[發(fā)明專利]用于實(shí)驗(yàn)鼠蛋白質(zhì)定量和示蹤的N15穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710043104.4
• 申請(qǐng)日: 2017-01-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106689697A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖傳樂(lè);陳龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州微因生物科技有限公司
• 主分類號(hào): A23K20/147
• 分類號(hào): A23K20/147;A23K10/30;A23K50/50;A01K67/02;C12N1/16;C12R1/645
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司44245
• 代理人: 梁瑩

1.一種用于實(shí)驗(yàn)鼠蛋白質(zhì)定量和示蹤的N¹⁵穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法，其特征在于：首先，利用酵母將N¹⁵無(wú)機(jī)鹽轉(zhuǎn)化成生物蛋白，當(dāng)酵母培養(yǎng)代數(shù)達(dá)到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N¹⁵的蛋白，再將酵母磨碎，釋放菌體所含蛋白質(zhì)，經(jīng)提取純化制成含N¹⁵的菌體蛋白粉末，同時(shí)利用N¹⁵無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)螺旋藻，當(dāng)螺旋藻培養(yǎng)代數(shù)達(dá)到6代以上，藻體中所含N元素98％以上都為N¹⁵，再將螺旋藻收獲、干燥后得到含N¹⁵的螺旋藻干粉，利用含N¹⁵的菌體蛋白粉末和含N¹⁵的螺旋藻干粉取代常規(guī)的N¹⁴原料制作成鼠糧，為實(shí)驗(yàn)鼠蛋白質(zhì)標(biāo)記定量和示蹤提供特異性的N¹⁵同位素標(biāo)記，其具體包括以下步驟：

1)按照以下配方配制只含N¹⁵的酵母菌無(wú)機(jī)培養(yǎng)基：

在1升的蒸餾水中，包含以下按質(zhì)量百分比計(jì)的組分：

使用高壓滅菌鍋，將步驟1)中的培養(yǎng)基在120攝氏度下滅菌20分鐘；

2)按照以下配方配制只含N¹⁵的螺旋藻無(wú)機(jī)培養(yǎng)基：

在1升的蒸餾水中，包含以下按質(zhì)量百分比計(jì)的組分：

使用高壓滅菌鍋，將步驟2)中的培養(yǎng)基在120攝氏度下滅菌20分鐘；

3)待步驟1)和2)中的培養(yǎng)基冷卻至室溫后，挑取單菌落酵母菌接種在酵母菌無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；選取所需藻種，接種在螺旋藻無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)溫度和光照，通入空氣并放在勻速振蕩器上培養(yǎng)，達(dá)到均勻的效果；

4)待酵母菌培養(yǎng)代數(shù)達(dá)到6代以上，取出培養(yǎng)基并離心，用滅菌后的生理鹽水清洗，得到酵母菌體；

6)收集到的菌體稱重后，與氯化鈉溶液以1:1～1.5的比例混合成新的菌液，放置于50～60℃環(huán)境下，定時(shí)震蕩，令酵母菌自溶釋放蛋白質(zhì)；

7)自溶后，用巴氏滅菌法令菌液中的酶失活，離心后收集液體；

8)將步驟7)中的液體冷凍干燥后，得到含N¹⁵的菌體蛋白粉末；

9)待螺旋藻培養(yǎng)代數(shù)達(dá)到6代以上，取出培養(yǎng)基并過(guò)濾，收集藻體；

10)用無(wú)菌水反復(fù)沖刷清洗藻體降低鹽分，清洗后的藻體均勻平鋪在廣口敞開(kāi)的容器中，放入冰箱冷凍；

11)將預(yù)凍好的螺旋藻放入熱風(fēng)干燥箱中干燥，得到含N¹⁵的螺旋藻干粉；

12)N¹⁵實(shí)驗(yàn)鼠飼料的配制：將步驟8)中制成的菌體蛋白粉末和步驟11)中制成的螺旋藻干粉作為飼料的基本氮源和主要碳源，取代常規(guī)的N¹⁴原料用于培養(yǎng)，再加入不含N元素的其他原料，制成最終的N¹⁵實(shí)驗(yàn)鼠飼料。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于實(shí)驗(yàn)鼠蛋白質(zhì)定量和示蹤的N¹⁵穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法，其特征在于：在步驟3)中，酵母將培養(yǎng)基中的N¹⁵無(wú)機(jī)鹽轉(zhuǎn)化成生物蛋白，螺旋藻將培養(yǎng)基中的N¹⁵無(wú)機(jī)鹽轉(zhuǎn)化為生物蛋白和其它含N物質(zhì)，當(dāng)酵母培養(yǎng)代數(shù)達(dá)到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N¹⁵的蛋白；當(dāng)螺旋藻培養(yǎng)代數(shù)達(dá)到6代以上，藻體中所含N元素98％以上都為N¹⁵，而實(shí)際操作中根據(jù)最終配制的實(shí)驗(yàn)鼠飼料選擇不同的酵母菌、螺旋藻和只含N¹⁵的無(wú)機(jī)培養(yǎng)基配方。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于實(shí)驗(yàn)鼠蛋白質(zhì)定量和示蹤的N¹⁵穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法，其特征在于：在步驟12)中，能夠依據(jù)情況配制N¹⁵實(shí)驗(yàn)小鼠飼料、N¹⁵實(shí)驗(yàn)大鼠飼料、N¹⁵實(shí)驗(yàn)豚鼠飼料，最終制備的飼料中N元素全部來(lái)源于步驟1)至步驟12)中經(jīng)提取純化后菌體蛋白粉末和螺旋藻干粉的N¹⁵，為實(shí)驗(yàn)鼠蛋白質(zhì)標(biāo)記定量和示蹤提供特異性的N¹⁵同位素標(biāo)記，而無(wú)機(jī)鹽和飼料的具體制作條件要根據(jù)實(shí)驗(yàn)鼠的生長(zhǎng)特征而定。