[發明專利]一種重組腺相關病毒載體生產工藝的建立

在審

• 申請號: 201710042618.8
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN108330147A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發明（設計）人: 李敏;姜軍;李亞楠;吳慶;沈浩
• 申請（專利權）人: 上海吉凱基因化學技術有限公司
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N7/00
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 李艷;許亦琳

1.一種重組腺相關病毒載體制備方法，包括如下步驟：

(1)將含有重組腺相關病毒載體基因組序列的質粒轉染入培養細胞；

(2)在合適的條件下培養步驟(1)所得細胞，收集細胞培養上清液，所述細胞培養上清液是指含有重組腺相關病毒載體的細胞和培養上清液的混合物；

(3)將步驟(2)所得的細胞培養上清液，進行純化和濃縮，即得重組腺相關病毒載體。

2.根據權利要求1所述的生產工藝，其特征在于，所述步驟(1)中，重組腺相關病毒載體基因組序列分別位于三個不同的載體質粒上，三個載體質粒分別為pHelper、prAAV-RC、prAAV-GFP。

3.根據權利要求1所述的生產工藝，其特征在于，所述步驟(1)中，所述培養細胞選自HEK293T。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，將步驟(2)所得的細胞培養上清液中的細胞和培養上清液進行分離，然后向分離后的培養上清液中加入PEG，離心沉淀重組腺相關病毒載體，重懸得PEG沉淀重懸液；分離后的細胞通過反復凍融法進行裂解，細胞裂解液通過微孔過濾器過濾，得過濾液；將所述過濾液與PEG沉淀重懸液合并，獲得病毒粗提液。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述PEG為PEG8000。

6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述微孔過濾器為PES過濾器。

7.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述病毒粗提液通過全能核酸酶進行處理，離心并澄清，然后通過氯仿處理并澄清，回收病毒液。

8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于，回收的病毒液再通過碘克沙醇密度梯度離心進行純化，回收純化后的病毒液。

9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，將回收的純化后的病毒液采用超濾濃縮柱進行超濾濃縮，獲得超濾濃縮后的病毒液。

10.根據權利要求9所述的制備方法，其特征在于，將超濾濃縮后的病毒液采用微孔過濾器過濾，進行終產物的收集。

11.如權利要求1～10任一項重組腺相關病毒載體制備方法在重組腺相關病毒載體制備領域的用途。