[發明專利]雙重PCR技術檢測蠟樣芽孢桿菌的引物對和方法

在審

• 申請號: 201710041994.5
• 申請日: 2017-01-20
• 公開（公告）號: CN108330185A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發明（設計）人: 王娉;李菲;趙曉美;陳穎
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/085
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及用于快速檢測蠟樣芽孢桿菌的引物和方法，其特征在于利用一對或多對引物和多重PCR的方法對蠟樣芽孢桿菌屬細菌的進行特異性檢測。本發明還涉及所述引物組合或試劑盒在檢測蠟樣芽孢桿菌屬細菌中的應用，使用本方法可以快速，簡潔，高靈敏度，高特異性地檢測蠟樣芽孢桿菌。

技術領域

本發明屬于生物技術領域。具體而言，本發明涉及用于檢測蠟樣芽孢桿菌屬細菌的高特異性和高靈敏度的2對核苷酸組合物，和使用該兩對引物的組合物進行的檢測方法及該組合物在實際樣品檢測中的應用。

背景技術

蠟樣芽孢桿菌分布廣泛，常見于土壤污水，在植物性食品和許多生熟食品也很常見。兼性好氧型的革蘭氏陽性桿菌。蠟樣芽孢桿菌大小為（1μm~1.3μm）×（3μm~5μm），能夠形成芽孢，菌體兩端較平整，多呈鏈狀排列，；在普通瓊脂上形成的菌落較大，灰白色，不透明，表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣常呈擴展狀。蠟樣芽孢桿菌是條件致病菌，最常見的通過腹瀉毒素和嘔吐毒素導致食品中毒。偶爾能通過菌體感染引起人的眼部疾病、心內膜炎、腦膜炎和菌血癥等疾病。在人們的日常生活中，大多數食物中毒都是由有害細菌引起的，在細菌性食物中毒中，蠟樣芽孢桿菌食物中毒是比較常見的。據我國食品污染物和食源性疾病監測網絡統計，2003年，蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒占所有食物中毒事件的4.0%，為細菌性食物中毒的第四位，而實際數據很可能遠大于各國官方報道，并且有增長的趨勢。

傳統的檢測方法依賴于生化鑒定和形態學特點，主要包括培養法、血清分析法等，這些檢測存在步驟繁瑣、費時費力、不易分辨、特異性差、靈敏度不高等缺點。基于蠟樣芽孢桿菌特異性基因的PCR檢測方法的快速靈敏，特異性強等的特點被廣泛應用，而快速靈敏和準確的多基因檢測是蠟樣芽孢桿菌發展的主要方向。蠟樣芽孢桿菌的污染在乳制品中也經常檢出，已經成為影響乳制品質量的主要微生物。眾所周知，原料乳品質的優劣對加工乳品的影響很大，鑒于上述情況，建立對蠟樣芽孢桿菌的快速、靈敏、高特異的檢測方法尤為重要。

聚合酶鏈式反應(PCR)是Kary Mullis在1985年發明的一種體外快速擴增目的基因的技術，該技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，包括模板DNA的變性、模板DNA與引物的退火和引物的延伸。擴增過程中以單鏈DNA為模板，人工合成的核苷酸為引物，并在DNA聚合酶的作用下沿著5’à3’方向擴增DNA片段，從而達到目的基因大量的復制。PCR的方法以用于多種多樣的基因檢測中。

多重PCR（Multiplex PCR）是在同一PCR反應體系里加上兩對或以上引物，針對同一個DNA模板的不同區域或者多個DNA模板進行擴增，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理、反應試劑和操作過程與一般PCR反應相同。其特點有：①高效性，在同一反應管內同時檢測多種病原微生物，或對有多個型別的目的基因進行分型，特別是用一滴血就可以檢測多種病原體。②系統性，mPCR很適宜成組病原體的檢測。③經濟簡便性，多種病原體在同一反應管內同時檢出，將大大節省時間，節省試劑，節約經費開支。

目前，國內少見報道能快速、簡單、特異且靈敏地針對蠟樣芽孢桿菌屬細菌檢測的雙重PCR方法。

因此，本領域亟需建立一種方便、特異性好、靈敏度高的蠟樣芽孢桿菌屬細菌的檢測方法，用于蠟樣芽孢桿菌的定性檢測。

發明內容

本發明的一個目的在于，提供檢測蠟樣芽孢桿菌屬細菌的核苷酸引物。

本發明的另一個目的在于，提供檢測蠟樣芽孢桿菌屬細菌的多重PCR檢測方法。

針對以上發明目的，本發明提供了以下技術方案。

一方面，本發明提供了兩對檢測蠟樣芽孢桿菌屬細菌的核苷酸引物，所述兩對引物為gyrB能編碼蠟樣芽孢桿菌具有高拷貝的旋轉酶的B亞基因，groEL能編碼分子伴侶蛋白。

在一個實施方式中，針對蠟樣芽孢桿菌gyrB基因的特異性引物對為：