[發(fā)明專(zhuān)利]一種免疫親和純化洗脫液的篩選方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710039621.4
• 申請(qǐng)日: 2017-01-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108333358B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 饒微;戚永躍;陳天貴;葉蕾蕾;徐紅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/58
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/58;G01N33/543
• 代理公司: 廣州華進(jìn)聯(lián)合專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 徐春祺

本發(fā)明公開(kāi)了一種免疫親和純化洗脫液的篩選方法，包括如下步驟：將第一配體、第二配體和磁球混合反應(yīng)得到第一免疫磁球復(fù)合物；采用洗脫液對(duì)第一免疫磁球復(fù)合物進(jìn)行洗脫，對(duì)得到的第二免疫磁球復(fù)合物進(jìn)行免疫測(cè)定獲得免疫數(shù)據(jù)，若不超過(guò)第一閾值，則判定為第一篩選洗脫液；采用第一篩選洗脫液對(duì)第一免疫磁球復(fù)合物進(jìn)行多次洗脫，對(duì)得到的第三免疫磁球復(fù)合物進(jìn)行免疫測(cè)定獲得免疫數(shù)據(jù)，若超過(guò)第二閾值，則判定為第二篩選洗脫液；采用第二篩選洗脫液對(duì)第二配體進(jìn)行放大檢測(cè)獲得免疫數(shù)據(jù)，若超過(guò)第三閾值，則判定為第三篩選洗脫液。這種免疫親和純化洗脫液的篩選方法采用磁球作為固相載體，磁球在洗脫過(guò)程中分散性好，假陽(yáng)性率低，可靠性高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫親和純化領(lǐng)域，特別是涉及一種免疫親和純化洗脫液的篩選方法。

背景技術(shù)

免疫親和層析是利用抗原、抗體之間高度特異性的親和力進(jìn)行分離的方法，即利用抗原或抗體中的一方作為配體，特異性抗體或抗原作為親和吸附的另一方的分離系統(tǒng)。免疫親和層析應(yīng)用相當(dāng)廣泛。許多蛋白質(zhì)純化過(guò)程已經(jīng)使用了單克隆抗體作為親和配體。即將抗體共價(jià)結(jié)合到一種惰性的微珠上，然后將微珠與含有待純化抗原的溶液混合。當(dāng)抗原被交聯(lián)在微珠上的抗體捕獲后，通過(guò)淋洗去除無(wú)關(guān)的蛋白，然后用洗脫緩沖液處理微珠，特異性結(jié)合的抗原被洗脫，從而得到純化的抗原。如果洗脫條件合適，純化的抗原仍能保持其天然狀態(tài)。免疫親和層析法同樣也可以用來(lái)分離經(jīng)過(guò)初步純化的抗體。此時(shí)抗原和抗體所起的作用正好相反，抗原共價(jià)交聯(lián)在微珠上，再與抗體結(jié)合，然后通過(guò)洗脫，得到純化的抗體。

影響免疫親和純化的關(guān)鍵的因素有：抗原最初的濃度，抗原與抗體的親和力以及抗原抗體結(jié)合是否容易發(fā)生解離。

在免疫親和純化技術(shù)中，抗原最初的相對(duì)濃度是決定最終產(chǎn)物純度的重要的因素，因?yàn)榭乖贵w的反應(yīng)具有相當(dāng)高的特異性，故而沒(méi)有任何其他層析技術(shù)能經(jīng)過(guò)一步純化得到如此高的純度。然而，純化的程度不是無(wú)限的，因?yàn)槭褂糜H和層析柱亦有某些內(nèi)在的背景限制，親和純化的純化倍數(shù)一般可達(dá)1000-10000倍。

抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親和力是免疫親合純化關(guān)鍵的因素，抗體的親和力將決定從含抗原的溶液中提取抗原的總量，高親和力的抗體(10⁸mol/L)能在1h以?xún)?nèi)達(dá)到有效地分離；而低親和力的抗體(10⁶mol/L)即使在高濃度時(shí)也不能結(jié)合溶液中的全部抗原。

影響免疫親和純化結(jié)果的第三個(gè)因素是哪種抗原相對(duì)容易被洗脫。這完全由抗原-抗體相互作用的結(jié)合鍵的類(lèi)型和數(shù)量來(lái)決定，因此這與抗體的親和力有關(guān)。然而親和力并不決定抗原是否容易洗脫。用于免疫親和純化的理想抗體是對(duì)抗原具有高親和力，與抗原的結(jié)合可被一種易于操作的簡(jiǎn)單而且溫和的方法如pH值的改變而逆轉(zhuǎn)。在設(shè)計(jì)免疫親和純化的方法時(shí)，通常認(rèn)為最重要的是選擇抗體和洗脫條件，在數(shù)種不同的洗脫條件下測(cè)試若干份有潛在使用價(jià)值的抗體，可發(fā)現(xiàn)高親和力與容易洗脫的優(yōu)化組合。

從免疫親和層析柱上洗脫抗原很快且較容易，大多數(shù)工作是花費(fèi)在設(shè)計(jì)和用于摸索各種有效的洗脫條件。可以采用三種方法進(jìn)行洗脫，以阻斷抗原抗體之間的相互作用：①用較強(qiáng)烈的條件處理；②加入模擬結(jié)合位點(diǎn)的飽和量小分子化合物；③使用一種能引起構(gòu)象改變而使抗原釋出的試劑。