[發明專利]一種稻曲病菌實驗室材料的常備形態及其制備與應用方法

在審

• 申請號: 201710034000.7
• 申請日: 2017-01-10
• 公開（公告）號: CN106754424A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 張君成;王忠文;蒲相君
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N3/00;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及植物病理學技術。具體是一種稻曲病菌實驗室材料的常備形態及其制備與應用方法。

背景技術

稻曲病是水稻的重要病害，發病嚴重時可給稻糧生產造成重大經濟損失。防病控害的有關研究，通常都要使用稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)材料。稻曲病菌在普通培養基上可緩慢生長成為菌絲體發達的菌落；在實驗室工作中，通常用試管斜面培養基將稻曲病菌培養成斜面菌落，并以菌落的菌絲體作為日常工作材料的常備形態。有關研究工作的出發點均以常備形態菌絲體材料為起始，通過移植常備形態菌絲體，進行擴大培養或進入具體項目的研究工作。這種以菌絲體作為日常工作材料的常備形態，通常較簡單方便，不過也存在某些不足，如下：

在與生長速率(或生長量)測定有關的研究工作(如生長發育的影響因素測定，藥物的抑制作用測定等)中，往往需要菌絲體的定量移植，而移植培養基中的菌絲體卻很難做到準確定量，至今的常規方法是需要先移植菌絲體到培養平板上擴大培養，然后用打孔器在擴大培養的平板菌落上打取等同直徑的菌絲塊，以此菌絲塊進行定量移植；這種定量方式不僅要增加一段擴大培養的程序環節，而且由于培養平板的厚薄不一致，以及菌落不同部位菌絲體的密集程度、生理狀態等也有差異，造成不同菌絲塊之間難以達到較高的一致性。

許多研究工作(如孢子萌發的影響因素，病害接種等)，使用的直接材料通常是薄壁分生孢子，同樣要將常備形態菌絲體移植到合適的培養基，先行孢子制備培養工作，獲得孢子后才能實施相關工作。這相當于相關工作進程需要延后，不能及時開展。

發明內容

本發明的目的是提供一種稻曲病菌實驗室材料的常備形態及其制備與應用方法。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

一種稻曲病菌實驗室材料的常備形態，是用稻曲病菌的薄壁分生孢子作日常工作的常備形態；薄壁分生孢子純凈無污染；薄壁分生孢子存放于無菌水中；薄壁分生孢子暫停生長發育，但轉到培養基上能馬上恢復正常生長發育。

一種稻曲病菌實驗室材料的常備形態的制備與應用方法，制備與應用方法步驟如下：

1.分生孢子的預培養

以當前實驗室稻曲病菌的常備菌絲體為初始菌體，采用常規的液體振蕩培養方法，培養獲得含有薄壁分生孢子的培養產物。

2.分生孢子的培養制備

用三角瓶作培養器具，裝盛馬鈴薯瓊脂培養基作產孢培養基，該培養基的組分配比為：馬鈴薯100g、瓊脂20g、水1000mL；用移液器從步驟1獲得的含有分生孢子的培養產物中，吸取少量液體，移植入三角瓶內的產孢培養基面上并涂布均勻，在合適的溫度下培養，直到培養基面上形成密布的微小菌落，菌落上形成大量的新一代薄壁分生孢子。

3.稻曲病菌材料常備形態的制備

取無菌水注入步驟2培養獲得的產孢菌落上，輕輕洗脫菌落上的孢子，獲得含有菌絲碎段的孢子液；用滅菌紗布過濾去除該孢子液中的菌絲碎段；將該孢子液進行離心沉淀，倒掉上清液，除去孢子液中混雜的菌體代謝產物和培養基組分；剩下的沉淀為純凈的薄壁分生孢子，以該純凈孢子作為稻曲病菌材料的常備形態；用無菌水將沉淀孢子懸浮，攪動使孢子充分分散，獲得稻曲病菌材料的常備孢子液。

4稻曲病菌材料常備形態的孢子含量標定

用無菌水將步驟3獲得的常備孢子液的孢子濃度，調配為10⁶孢子/mL。

5稻曲病菌材料常備形態的日常存放

在無菌條件下，將步驟4標定的常備孢子液分裝到有蓋密閉的滅菌容器內，并轉移到25℃的暗環境中存放備用。

6稻曲病菌材料常備形態的應用

將步驟5存放的稻曲病菌材料常備孢子液轉到超凈工作臺，振蕩裝存常備孢子液的容器，使薄壁分生孢子充分懸浮和分散；開蓋后用移液器定量吸取孢子液，移植到相關的工作環節或實驗程序中；吸液移植操作完畢后回蓋密封，將剩余的常備孢子液轉回步驟5的存放處存放。

本發明的特色與優點是：

1)常備形態的薄壁分生孢子在純水中暫停生長但能長期保持活力，一旦轉到培養基，能馬上恢復正常生長。

2)可在相關工作中隨時應用，能為需要薄壁分生孢子的試驗環節直接提供菌體材料，可省去使用菌絲體作為常備材料時，需要反復制備培養孢子的工作程序，工作方便快捷。

3)用三角瓶作培養器具，容易獲得無污染的純凈孢子液，制備獲得的常備形態質量較高。

4)能標定常備孢子液的孢子含量，應用時可以準確定量取用，利于技術方法標準化。

附圖說明