[發明專利]一種減少污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養方法

在審

• 申請號: 201710033964.X
• 申請日: 2017-01-10
• 公開（公告）號: CN106701653A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 張君成;張麗麗;王忠文
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及植物病理學技術。具體是一種減少污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養方法。

背景技術

稻曲病是水稻上的重要病害，可給水稻生產造成重大損失。該病害由稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)侵染造成。分生孢子是稻曲病菌的無性繁殖體，在稻曲病的病害循環和病害流行中發揮重大作用。在實驗室內，分生孢子也是稻曲病研究不可缺少的材料。有關孢子的形成發育生理、對不良環境的生存適應性或抵抗性，孢子與寄主的識別互作反應等研究，都需要使用孢子形態的材料；新型防治藥物研發方面的有關研究，如藥劑對孢子的致毒效應等，也需要孢子；分子生物學領域的有關研究，如致病相關基因的誘變、定位與克隆等；也離不開孢子；可見，分生孢子是稻曲病日常研究的重要的菌體形態。而且在許多工作中，往往要求研究所用的分生孢子純凈無污染。

稻曲病菌可形成兩種形態的分生孢子，一種為厚壁分生孢子，另一種為薄壁分生孢子。在實驗室工作中，由于培養制備厚壁分生孢子存在較大的技術困難，因而多使用其薄壁分生孢子，后文的“分生孢子”或“孢子”均指稻曲病菌的薄壁分生孢子。

長期以來，文獻公開的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養方法，主要是液體培養方法，該方法的主要技術步驟是，先培養準備稻曲病菌的菌絲體，再將菌絲體移植入液體培養基進行液體振蕩培養，直至獲得孢子；該培養方法可以獲得大量的分生孢子，不過，實踐工作中也發現一些不足，如耗時較長，整個過程一般需要15天以上；培養產物混合液中包含有大量的培養基組分、菌體代謝產物和菌絲團等；培養工作需要振蕩培養設備；由于該孢子較小且培養產物呈粘稠狀態，要沉淀獲得較為單純的孢子液，往往需要高速離心機設備。

隨著研究探索的進展，最近已經建立了稻曲病菌薄壁分生孢子的固體培養方法，即用培養皿作培養器具，用瓊脂固體培養基培養制備孢子。該方法可彌補上述液體培養方法的一些不足，不過又出現另一弊病，就是緣于培養皿的結構特性，制備培養的孢子成品容易被污染。

一般實驗室使用的培養皿由皿底和皿蓋組成，限于當前培養皿的制作工藝技術，皿底與皿蓋間很難達到均勻貼合的程度，大多數培養皿的皿底與皿蓋間存在較大縫隙，培養皿內外的空氣流動可暢通無阻。因此，利用普通培養皿制備培養的分生孢子產物容易受外界污染空氣的干擾，容易得到帶有雜菌污染的孢子成品。尤其是一般的植物病理學實驗室，當前均偏好于配置具有降溫/升溫功能的培養箱，該類培養箱通常為了實現工作室內快速恒溫及溫度均勻分布狀態，往往將工作室設計為循環空氣的模式。利用這類培養箱進行的產孢培養，培養皿周圍空氣處于常流動狀態，造成培養皿內材料污染的機率相當高，通常培養5天可造成50％以上的培養平板被雜菌污染，即使一些培養平板上看不到明顯的青霉菌等污染菌的菌落，但肉眼看不到的污染機率仍然較大。因此，利用培養皿制備培養稻曲病菌分生孢子，在技術上很難排除污染的可能。

發明內容

本發明的目的是提供一種減少污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養方法。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

一種減少污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養方法，制備培養方法的步驟如下：

1.采用普通三角瓶作制備培養孢子的器具，將三角瓶潔凈備用。

2.瓶式產孢培養基的制備

用馬鈴薯培養基作產孢培養基，該培養基的配比為：馬鈴薯100g、瓊脂20g、水1000mL；將培養基分裝于步驟1準備的三角瓶，常規高壓高溫滅菌后成為三角瓶式培養基，備用。

3.母代稻曲病菌的移植

以實驗室已有的稻曲病菌分生孢子液作母代菌體，用移液器將該母代孢子液移植入步驟2制備的三角瓶式培養基，并使孢子液在培養基面上分散均勻。

4.產孢培養

將步驟3操作完備后的三角瓶式培養基轉入溫度為28℃的普通培養箱內培養。

5.新一代孢子的收集

通常步驟4培養5天后，培養基面上已形成大量的微小菌落，菌落上形成大量的分生孢子；用無菌水洗脫菌落上的孢子，并集中到滅菌容器內，即獲得無雜菌污染的較高質量的稻曲病菌薄壁分生孢子液。

本發明的特色與優點是：

1)無需振蕩培養設備，獲得的分生孢子液成品含菌絲體、培養基、及菌體代謝外泌產物等較少。

2)三角瓶配上常規瓶塞后，能阻隔普通微生物的通過，很好地保護三角瓶內不受雜菌污染，因而能有效減少污染，獲得高質量的孢子成品。

3)產孢菌落一般不產生茂密的氣生菌絲。