[發明專利]高效防止污染的番茄灰霉病菌分生孢子的制備培養方法

在審

• 申請號: 201710033621.3
• 申請日: 2017-01-10
• 公開（公告）號: CN106754621A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 張君成;楊平;曾東強
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及植物病理學技術。具體是一種高效防止污染的番茄灰霉病菌分生孢子的制備培養方法。

背景技術

番茄灰霉病是蔬菜番茄上的重要病害，可給番茄生產造成重大損失。該病害由灰霉病菌(Botrytis cinerea)侵染造成。分生孢子是灰霉病菌的無性繁殖體，在番茄灰霉病的病害循環和病害流行中發揮重大作用。在實驗室內，分生孢子也是番茄灰霉病研究不可缺少的材料。有關孢子的形成發育生理、對不良環境的生存適應性或抵抗性，孢子與寄主的識別互作反應等研究，都需要使用孢子形態的材料；新型防治藥物研發方面的有關研究，如藥劑對孢子的致毒效應等，也需要孢子；分子生物學領域的有關研究，如致病相關基因的誘變、定位與克隆等；也離不開孢子；可見，分生孢子是番茄灰霉病日常研究的重要的菌體形態。而且在許多工作中，往往要求研究所用的分生孢子要達到沒有雜菌污染的狀態。

在實驗室工作中，由于番茄灰霉病菌在常規培養基上容易形成分生孢子，因而該病菌分生孢子的常規培養獲取方法是，利用普通培養皿作為培養器具，在培養皿內的培養基平板上培養制備該分生孢子。

一般實驗室使用的培養皿由皿底和皿蓋組成，限于當前培養皿的制作工藝技術，皿底與皿蓋間很難達到均勻貼合的程度，大多數培養皿的皿底與皿蓋間存在較大縫隙，培養皿內外的空氣流動可暢通無阻。因此，利用普通培養皿培養制備的分生孢子容易受外界污染空氣的干擾，容易得到帶有雜菌污染狀態的孢子成品。尤其是一般的植物病理學實驗室，當前均偏好于配置具有降溫/升溫功能的培養箱，該類培養箱通常為了實現工作室內快速恒溫及溫度均勻分布狀態，往往將工作室設計為循環空氣的模式；利用這類培養箱實施的產孢培養，培養皿周圍空氣處于常流動狀態，造成培養皿內材料污染的機率相當高，通常培養7天可造成50％以上的培養平板被雜菌污染，即使一些培養平板上看不到明顯的青霉菌等污染菌的菌落，但肉眼看不到的污染情況仍然存在。因此，利用培養皿培養制備番茄灰霉病菌分生孢子，在技術上很難排除污染的可能。

發明內容

本發明的目的是提供一種高效防止污染的番茄灰霉病菌分生孢子的制備培養方法。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

高效防止污染的番茄灰霉病菌分生孢子的制備培養方法，制備培養方法的步驟如下：

1.采用普通三角瓶作制備培養孢子的器具，將三角瓶潔凈備用。

2.瓶式培養基的制備：用馬鈴薯葡萄糖培養基作產孢培養基，該培養基的配比為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL；將培養基分裝于步驟1準備的三角瓶，常規高壓高溫滅菌后成為瓶式培養基，備用。

3.番茄灰霉病菌的移植：用移植工具將實驗室常備的番茄灰霉病菌菌絲體，移植入步驟2制備的瓶式培養基上。

4.培養產孢：將步驟3操作完備后的瓶式培養基轉入溫度為23℃的普通培養箱內培養；通常培養7天后，瓶式培養基面上已形成菌絲密集的菌落，菌落上形成大量的分生孢子。

5.分生孢子的收集：用無菌水洗脫步驟4獲得的菌落上的孢子，并集中到滅菌容器內，即獲得無雜菌污染的較高質量的番茄灰霉病菌分生孢子液。

本發明的優點是：

1)三角瓶配上常規瓶塞后，能阻隔普通微生物的通過，很好地保護三角瓶內不受雜菌污染，獲得高質量的孢子成品。

2)三角瓶內收集孢子比培養皿內收集孢子的操作更為方便。

3)三角瓶的保護可使得產孢菌落能隨意放置一段時間而不受污染，并保持產孢狀態，便于與需要孢子的工作程序銜接。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步描述。

本發明的關鍵技術是三角瓶與瓊脂類培養基的結合與應用。

三角瓶雖然屬植物病理學實驗室的日常器具，但其常規用途主要是裝盛培養基滅菌；也常見用于裝盛液體培養基、或植物組織類培養基(如籽粒、秸桿等)進行病原菌培養。

瓊脂類培養基的應用，現有的技術規范都是使用培養皿作培養器具，將瓊脂培養基加熱熔化后，倒入培養皿制成培養基平板，并在該培養平板上培養病原菌。

番茄灰霉病菌分生孢子在瓊脂培養基上的制備培養，均為應用常規的技術規范，即利用培養皿結合瓊脂類培養基的培養技術進行制備培養；至今還未見有利用三角瓶作培養器具，在瓊脂類培養基上進行番茄灰霉病菌產孢培養的孢子制備技術?？赡茉蚴菍ε囵B皿的長期依賴及習慣沿用，以及通常認為病原菌產孢需要通氣性良好的環境條件，而培養皿恰好能滿足良好的通氣性。