[發明專利]抗游離棉酚通用單克隆抗體及其應用

在審

• 申請號: 201710033126.2
• 申請日: 2017-01-18
• 公開（公告）號: CN106916790A
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發明（設計）人: 李愛科;韓飛;陳曦;王薇薇;王麗;王永偉
• 申請（專利權）人: 國家糧食局科學研究院
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;G01N33/535;G01N33/543;G01N33/577
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司11257
• 代理人: 張文祎,趙曉丹

技術領域

本發明涉及免疫學檢測分析技術領域，更具體地，涉及雜交瘤細胞株2D4及其產生的抗游離棉酚通用單克隆抗體和應用。

背景技術

棉酚(gossypol)是存在于錦葵科植物屬色素腺產生的多酚萘衍生物，存在于葉和種子中。棉酚的結構為1,1’6,6’7,7’-六羥基-3,3’-二甲基-5,5’-二異丙基-2,2’-聯萘-8,8’-二醛。棉酚按其存在形式可分為游離棉酚和結合棉酚兩類。游離棉酚中的活性基團(醛基和羥基)可與蛋白質結合，破壞酶活，降低蛋白質消化率，導致動物生長遲緩、中毒及死亡。

棉籽榨油后棉酚部分轉化為游離棉酚殘留在棉籽餅粕中，平均含量為700-1920mg/kg。棉粕蛋白含量高，營養價值接近豆粕，在蛋白質原料緊缺的形勢下，棉籽餅粕作為優質蛋白質原料在中國畜禽生產中應用日漸廣泛，但棉籽餅粕中含有游離棉酚，如果在日糧中使用不當，容易造成動物棉酚中毒，同時人類如果食用含棉酚畜產品也存在安全風險。因此，歐盟、中國、美國等國家和地區制定了飼料、飼料原料和人類食品中棉酚含量限量標準。其中，中國現行飼料衛生標準(GB13078-2001)對于飼料中游離棉酚允許量規定為棉籽餅粕原料≤1200mg/kg。棉酚是棉籽中重要內源毒素質量參數，建立快速、高效、簡便的游離棉酚檢測方法能夠為收購過程中質量定標提供保障。

目前檢測棉籽餅粕及棉籽油中游離棉酚的方法主要包括高效液相色譜法、高效毛細管電泳法、高效液相質譜聯用法、分光光度法(苯胺法)、免疫化學分析法等。但是，高效液相色譜法、高效毛細管電泳法、高效液相質譜聯用法等運用儀器的方法雖然靈敏度較高、操作簡單，但對儀器設備要求高、檢測費用高，很難推廣使用；分光光度法雖然普遍，但該方法存在靈敏度低、毒性大、操作費時等缺點。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高靈敏、對技術人員相對要求低等特點，適用于大量樣品的快速篩查。因此，提供對游離棉酚具有較高親和力和檢測靈敏度的單克隆抗體，對于檢測棉籽餅粕及棉籽油中游離棉酚具有非常重要的意義。

發明內容

本發明的一個目的是提供抗游離棉酚通用單克隆抗體雜交瘤細胞株；

本發明的另一個目的是提供有上述雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體，該抗體對游離棉酚具有較好的親和力和檢測靈敏度，可以用來建立測定棉籽及其制品中游離棉酚總量的免疫學檢測方法。

為達到上述目的，本發明采用下述技術方案：

本發明抗游離棉酚通用單克隆抗體的雜交瘤細胞株2D4已于2015年5月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC No.10872，分類命名為單克隆細胞株。

本發明抗游離棉酚通用單克隆抗體是由保藏號為CGMCC No.10872的小鼠單克隆抗體雜交瘤細胞株2D4所分泌。

上述抗游離棉酚通用單克隆抗體的雜交瘤細胞株和其所分泌的單克隆抗體均屬于本發明的保護范圍。

本發明所述雜交瘤細胞株或單克隆抗體可應用于檢測棉籽及其制品中的游離棉酚。

進一步，本發明所述雜交瘤細胞株或單克隆抗體可用于制備用于檢測棉籽及其制品中游離棉酚的藥劑或試劑盒中。

本發明提供的抗游離棉酚通用單克隆抗體的雜交瘤細胞株2D4的制備基本步驟為：

(1)免疫原的制備與鑒定：取醋酸棉酚溶于甲醇中，與BSA(牛血清白蛋白)溶液混合，之后加入氰基硼氫化鈉(NaBH₃CN)，室溫下避光攪拌。之后用PBS溶液透析，分裝保存；

(2)小鼠的免疫：將抗原與等量弗式佐劑混合均勻后，通過頸背部多點注射免疫BALB/c小鼠。免疫過程總共六次：首次每只100μL，間隔21天，之后二免到五免每只50ul，最后一次為腹腔沖刺免疫，每只25ul；

(3)細胞融合與細胞株建立：通過聚乙二醇(PEG4000)法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，通過HAT培養基培養，利用間接ELISA檢測陽性細胞孔，并進一步利用間接競爭ELISA法測定陽性細胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細胞孔進行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細胞株2D4；

(4)雜交瘤細胞株性質的鑒定：采用小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用酶標二抗套裝測定；通過ELISA法測定IC50值。

其中，在步驟(1)中，醋酸棉酚的醛基與蛋白上的氨基發生縮合反應后，形成席夫堿，但由于碳氮雙鍵不穩定，故又通過加入氰基硼氫化鈉來還原碳氮雙鍵為單鍵，使偶聯產物可以穩定存在。