[發(fā)明專利]一種慢病毒載體、重組慢病毒質(zhì)粒、病毒及病毒的應用

在審

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• 申請日: 2017-01-17
• 公開（公告）號: CN107058390A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設計）人: 徐明;姜斌;袁海花;劉峰;龔玉芳
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N7/01;A61K35/17;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 上海精晟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司31253
• 代理人: 馮子玲

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于細胞免疫治療領域，具體涉及一種慢病毒載體、重組慢病毒質(zhì)粒、病毒及病毒的應用。

背景技術(shù)

嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)作為一種合成跨膜蛋白，以單鏈可變區(qū)(single chain variable fragment，scFv)取代TCR的a、G鏈可變區(qū)，并與T細胞信號傳導區(qū)域CD3ζ連接，當scFv識別腫瘤細胞表面特異性抗原，直接將信號向細胞內(nèi)傳導，使T細胞活化并分泌細胞因子，殺傷腫瘤細胞[1]。此外，額外的胞內(nèi)細胞傳導信號結(jié)構(gòu)域也被加入進來，例如CD28與4-1BB，由此也被分別稱為2代和3代CARs[1]。CAR-T細胞免疫療法也正是近幾年被改良使用到臨床上的新型細胞療法，在急性淋巴細胞白血病(acutelymphoblasticleukemia，ALL)[2]和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)[3,4]的治療上有著顯著的療效，被認為是目前最有前景的腫瘤治療方式之一。

大多數(shù)的CAR都以腫瘤相關性抗原作為靶點，現(xiàn)階段常用的靶點除CD19以外[2,3]，也有相關報道以ERRB2(HER-2)治療膠質(zhì)瘤[5]和骨肉瘤[6]。盡管尚不詳盡，但它清晰的表明CAR-T細胞在抗腫瘤方面的廣泛應用前景。然而，CAR-T細胞免疫療法仍面臨著諸多實際困難，最顯著的是CAR-T細胞回輸患者體內(nèi)引起的強烈免疫反應，亦稱“細胞因子風暴”。同樣，CAR-T策略的治療作用仍然存在諸多問題，主要歸納為以下幾點：1)腫瘤微環(huán)境對CAR-T細胞的抑制效應，以氧化應激，缺氧以及酸性pH值為主要特征；2)腫瘤源的可溶性免疫抑制因子或細胞因子，譬如TGF-β、IL-10以及可溶性的PD-L1對CAR-T細胞的拮抗作用；3)免疫抑制性的免疫細胞對CAR-T細胞的抑制作用，例如調(diào)節(jié)性T細胞(T_regs)，骨髓源的抑制性細胞(MDSC)，腫瘤相關的巨噬細胞(TAM)或者腫瘤相關性的中性粒細胞(TAN)；4)T細胞固有的負調(diào)節(jié)機制以及抑制性分子的過度表達，譬如易受腫瘤微環(huán)境誘導表達的PD-1分子，被腫瘤細胞表面配體PD-L1識別結(jié)合，導致T細胞功能受損而喪失向免疫系統(tǒng)發(fā)出攻擊腫瘤細胞的信號；5)CAR-T細胞自身毒性和免疫原性也是亟待解決的問題。

PD-1是一種重要的細胞免疫抑制分子，以PD-1為靶點的免疫調(diào)節(jié)對抗腫瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意義[7]。目前，免疫抑制PD-1和PD-L1已在多種實體腫瘤治療中取得較顯著的效果，包括肺癌[8]、胃癌[9]、卵巢癌[10,11]等。有研究表明，anti-Her2CAR刺激的T細胞能夠顯著增強CD8⁺T細胞表面的PD-1的表達，同時伴隨著乳腺癌細胞表面PD-L1的表達增多，抑制CAR-T細胞介導殺傷腫瘤細胞的信號，然而當免疫抑制PD-1或PD-L1后，能夠顯著增強CAR-T細胞清除腫瘤細胞的功能[12,13]。目前全球已批準臨床使用的PD-1抗體為Opdivo和Keytruda，根據(jù)多項臨床研究數(shù)據(jù)表明，這兩個PD-1抗體單用在不同的腫瘤適應癥中有效率為20％左右，且3級/4級藥物相關的不良反應發(fā)生率高，并觀察到藥物相關肺毒性引起死亡的病例[14,15]。

鑒于此，若能將CD19嵌合體抗原受體與針對PD-1的發(fā)卡RNA干擾基因同時整合到細胞的基因組上，并使其發(fā)揮相應的生物功能，將有望提高免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷效率。