[發(fā)明專利]甘藍(lán)型油菜nap細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rfn的克隆及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710030300.8
• 申請日: 2017-01-17
• 公開（公告）號: CN106754964B
• 公開（公告）日: 2019-11-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊光圣;劉智;董發(fā)明;洪登峰;萬麗麗;辛強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué);武漢聯(lián)農(nóng)種業(yè)科技有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/20;C12Q1/6895
• 代理公司: 11470 北京精金石知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 強(qiáng)紅剛<國際申請>=<國際公布>=<進(jìn)入

本發(fā)明提供了一種甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。本發(fā)明分離的甘藍(lán)型油菜nap細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rfn，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，它編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。該基因?qū)儆赑PR基因家族的成員，為一個(gè)組成型表達(dá)的基因。將Rfn轉(zhuǎn)化導(dǎo)入不含有nap細(xì)胞質(zhì)恢復(fù)基因的油菜，可以獲得育性恢復(fù)的植株。恢復(fù)基因Rfn的克隆及驗(yàn)證可用于甘藍(lán)型油菜優(yōu)良自交系和常規(guī)品種選育，解決部分材料在低溫條件下花粉不足、產(chǎn)量下降的現(xiàn)象。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種甘藍(lán)型油菜nap細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

植物雄性生殖器官不能產(chǎn)生正常的雄配子即花粉的現(xiàn)象稱為雄性不育，具有雄性不育特性的植物或作物品系稱為不育系。而一些品系與不育系雜交能夠產(chǎn)生具有正常育性的植株，這些植物或作物品系稱為恢復(fù)系。利用不育系作母本和恢復(fù)系作父本雜交進(jìn)行雜交，可配制高純度的雜交種。因此，不育系和恢復(fù)系在作物雜交育種中具有重要價(jià)值。

對于雄性不育及其育性恢復(fù)的研究在多種農(nóng)作物如水稻、小麥、玉米、大豆、油菜等已有報(bào)道，在生產(chǎn)上已廣泛應(yīng)用于雜交種生產(chǎn)。雄性不育的遺傳基礎(chǔ)包括核基因控制的細(xì)胞核雄性不育(Genic male sterility,簡稱GMS)和細(xì)胞質(zhì)控制的細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility,簡稱CMS)。利用CMS及其育性恢復(fù)特性進(jìn)行雜交育種的方法通常稱為“三系法”，即不育系、恢復(fù)系和保持系。其中不育系具有線粒體基因組中特異基因控制的細(xì)胞質(zhì)雄性不育特性?；謴?fù)系具有正常的細(xì)胞質(zhì)或不育的細(xì)胞質(zhì)，花粉正?？捎?，自交可結(jié)實(shí)，其特點(diǎn)是核基因組中攜帶育性恢復(fù)基因(fertility restorer gene，簡稱Rf)。保持系具有正常的細(xì)胞質(zhì)，花粉正常可育，但其核基因組中不攜帶有功能的恢復(fù)基因。

甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育有多種類型，如同源胞質(zhì)類型nap CMS和pol CMS；異源胞質(zhì)類型有ogu CMS，tour CMS，hau CMS等。pol CMS、ogu CMS及tour CMS在國內(nèi)外油菜雜交育種中有較廣泛的應(yīng)用。由于大部分甘藍(lán)型油菜栽培品種中均含有nap CMS的恢復(fù)基因而表現(xiàn)為可育。只有少數(shù)品種由于缺少恢復(fù)基因Rfn而表現(xiàn)為不育或部分不育，同時(shí)napCMS不育植株在相對較高的溫度情況下就會變?yōu)椴糠挚捎蛲耆捎?Fan和Stefan,1986)，限制了該系統(tǒng)在油菜雜交種生產(chǎn)上的應(yīng)用。然而在甘藍(lán)型油菜自交系或常規(guī)品種選育過程中，經(jīng)常有品種出現(xiàn)分段結(jié)實(shí)的現(xiàn)象。具體表現(xiàn)為：低溫條件下，有效花序段部分花蕾在尚未開放時(shí)即黃化脫落，或能正常開花但不能正常發(fā)育結(jié)實(shí)，有的花即使能發(fā)育成角果，但每個(gè)角果僅有少量種子，而在溫度較高的情況下則結(jié)實(shí)完全正常。這必將導(dǎo)致無效角果增加，產(chǎn)量下降。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rfn，利用該基因可恢復(fù)甘藍(lán)型油菜nap CMS的育性，或作為分子標(biāo)記，促進(jìn)甘藍(lán)型油菜優(yōu)良自交系和常規(guī)品種選育。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗(yàn)研究并不懈努力，最終從甘藍(lán)型油菜中分離得到一種甘藍(lán)型油菜nap CMS的恢復(fù)基因Rfn，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:1所示。

根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段，本發(fā)明人可以采用已克隆的多核苷酸序列作為探針，從基因組或cDNA文庫中篩選得到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，采用PCR技術(shù)也可以從基因組和cNDA中擴(kuò)增得到本發(fā)明的基因或任何一段感興趣的核苷酸序列或與其同源的核苷酸序列。因此，在嚴(yán)格條件下與序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列也屬于甘藍(lán)型油菜nap CMS的恢復(fù)基因序列。

進(jìn)一步地，上述任意一種核苷酸序列經(jīng)核苷酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體也屬于甘藍(lán)型油菜nap CMS的恢復(fù)基因序列。