[發(fā)明專(zhuān)利]一種瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑及其應(yīng)用方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710029440.3
• 申請(qǐng)日: 2017-01-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106591339A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-04-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊亮;左澤乘;莫偉亮;姚楠;樸明鑫;邊鳴鏑;楊振明
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/63
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/63;C12N15/85
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因轉(zhuǎn)染技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑及其應(yīng)用方法，是一種可以高效簡(jiǎn)便毒害小的轉(zhuǎn)染試劑。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)染需要一定的轉(zhuǎn)染試劑將帶有目的基因的載體運(yùn)送到宿主細(xì)胞內(nèi)。目前，最常用的轉(zhuǎn)染試劑是陽(yáng)離子脂質(zhì)體和陽(yáng)離子聚合物，它們的特點(diǎn)和病毒類(lèi)似，容易透過(guò)細(xì)胞膜。其中，陽(yáng)離子脂質(zhì)體在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率，然而在體內(nèi)，它迅速被血清清除，在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)，這將導(dǎo)致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其應(yīng)用。由于陽(yáng)離子脂質(zhì)體的局限性，陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑日益受到重視。

本試劑采用陽(yáng)離子聚合物為主要成分，可以與 DNA 形成穩(wěn)定的復(fù)合物，保護(hù) DNA 免受核酸酶的降解，在增加核酸穩(wěn)定性的同時(shí)，提高轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合體穿越細(xì)胞膜的效率，這種獨(dú)特設(shè)計(jì)，顯著提高了基因轉(zhuǎn)染效率。此類(lèi)試劑是目前非病毒介導(dǎo)方法中效率極高的轉(zhuǎn)染試劑（不同種類(lèi)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率可有明顯差異），可與lipo3000相媲美。此外此轉(zhuǎn)染試劑不被血清清除，血清和抗生素不影響其轉(zhuǎn)染效果，轉(zhuǎn)染試劑/DNA 復(fù)合物可以直接加入完全細(xì)胞培養(yǎng)基中。它的細(xì)胞毒性很小，在適宜的條件下，根據(jù)推薦用量使用其進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞存活率高于95%。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有轉(zhuǎn)染試劑的不足，本發(fā)明提供一種瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑及其應(yīng)用方法，具有轉(zhuǎn)染效率高且穩(wěn)定、細(xì)胞毒性小、操作簡(jiǎn)便省時(shí)、溶液穩(wěn)定、適應(yīng)宿主細(xì)胞范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑，其成分為：高效線性聚乙烯亞胺PEI-MAX和ddH₂O,溶液PH為7.05。

在使用該瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒時(shí)，質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例介于1微克:1.5微升至1微克:4微升之間，最優(yōu)比例為1微克:3微升。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑的使用方法，包括如下步驟：

（1）將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑按照比例混合，用opti-MEM或者ddH₂O稀釋?zhuān)?/p>

（2）室溫孵育5min后加入到DMEM培養(yǎng)基中；

（3）24-36h后即可進(jìn)行檢測(cè)。

該瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑溶液穩(wěn)定性高，在4℃及-20℃條件下均可以長(zhǎng)期保存；轉(zhuǎn)染效率高；細(xì)胞毒性低，細(xì)胞存活率高于95%。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于成本低廉，轉(zhuǎn)染效率高，適合宿主范圍廣，轉(zhuǎn)染方便快捷，對(duì)細(xì)胞毒性小，溶液穩(wěn)定性高。

附圖說(shuō)明

圖1 DNA（3μg GFP質(zhì)粒）和轉(zhuǎn)染試劑不同的比例轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24h顯微鏡觀測(cè)蛋白表達(dá)情況，推薦使用1:3轉(zhuǎn)染；

圖2 GFP和mcherry質(zhì)粒各1.5μg，按照不同的比例做轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24h顯微鏡觀測(cè)蛋白表達(dá)情況，因此推薦共轉(zhuǎn)染的時(shí)候質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑比例為1:4；

圖3 在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染3μgGFP和mcherry，PEI-max和lipo3000對(duì)比圖；

圖4在HELA細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染3μgGFP和mcherry，PEI-max和lipo3000對(duì)比圖；

圖5在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染500ng啟動(dòng)子G的質(zhì)粒和其激活蛋白質(zhì)粒各1μg，轉(zhuǎn)染24h后檢測(cè)luciferase的活性；

圖6 在HEK293T細(xì)胞中各轉(zhuǎn)染2μgCRY2和SPA1質(zhì)粒，24h后分別藍(lán)光處理1.5h，3.5h后做免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 轉(zhuǎn)染

（1）首先向離心管中加入150μLoptiMEM培養(yǎng)基，再個(gè)加入3μgGFP質(zhì)粒，而后按照質(zhì)粒（μg）：轉(zhuǎn)染試劑（μL）1:1.5、1:2、1:3、1:4、1:6加入PEI-max轉(zhuǎn)染試劑。并以商業(yè)化的轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 3000為對(duì)照進(jìn)行參比。

（2）室溫孵育5min后加入到DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中；

（3）24-36h后進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，可見(jiàn)質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的比例在1：3:時(shí)轉(zhuǎn)染效果最佳。轉(zhuǎn)染效果接近商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 3000。

實(shí)施例2 共轉(zhuǎn)染

共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒：GFP與mcherry質(zhì)粒各1.5μg；具體轉(zhuǎn)染方案同實(shí)施例1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，從GFP和mCherry共轉(zhuǎn)染對(duì)比圖可以看出，三個(gè)轉(zhuǎn)染條件兩種蛋白均有大量的表達(dá)。

實(shí)施例3 蛋白共表達(dá)與商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑比較：