[發(fā)明專利]區(qū)分clade2.3.4和clade7.2 H5 AIV的實時熒光定量PCR引物

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710029006.5
• 申請日: 2017-01-16
• 公開（公告）號: CN106702026B
• 公開（公告）日: 2020-02-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 萬春和;施少華;黃瑜;程龍飛;傅光華;陳翠騰;陳紅梅;傅秋玲;劉榮昌
• 申請（專利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 35100 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 蔡學(xué)俊

本發(fā)明提供了一組區(qū)分clade2.3.4和clade7.2 H5 AIV實時熒光定量PCR引物，利用clade2.3.4和clade7.2 H5 AIV血凝素基因（HA）特征性核苷酸序列存在GC含量差異來設(shè)計。利用本組引物對clade2.3.4和clade7.2 H5 AIV進行實時熒光定量PCR反應(yīng)均可有效擴增，但其在clade2.3.4和clade7.2 H5 AIV的實時熒光定量PCR反應(yīng)后生成的熔解曲線存在熔解溫度（Tm值）差異來對clade2.3.4和clade7.2 H5 AIV進行有效區(qū)分。配合和實時熒光定量PCR儀器連接的電腦并利用儀器自帶的分析軟件，可達(dá)到僅需一組引物，即可特異性的對clade2.3.4和clade7.2 H5 AIV感染情況進行鑒別診斷。本發(fā)明鑒定方法簡單，效率和準(zhǔn)確率較高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動物傳染病學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一組區(qū)分clade2.3.4和clade7.2 H5AIV的實時熒光定量PCR引物。

背景技術(shù)

禽流感（Avian influneza，AI）是由A型流感病毒引起的、主要侵害家禽及野鳥的一種急性、高度接觸性傳染病。高致病性H5亞型禽流感病毒（H5 subtype avian influenzavirus, H5 AIV）引起的感染目前已被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報告的動物傳染病，在我國被列為一類動物疫病。

關(guān)于流感的最早記錄可追溯到1878年來自意大利的一次報道，隨后世界各地陸續(xù)發(fā)生流感的暴發(fā)和流行。1996年，在我國分離到的第一株H5N1亞型HPAIV [A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1），GS/GD/96]，緊接著香港于1997年發(fā)生H5N1亞型禽流感病毒直接感染人事件，這是第一個禽源流感病毒未經(jīng)中間宿主而直接感染人的證據(jù)。由于從祖源病毒GS/GD/96進化出多個譜系且命名不統(tǒng)一，為此WHO、FAO和OIE聯(lián)合制定了H5N1 HPAIV統(tǒng)一分類準(zhǔn)則將H5N1 HPAIV分為0~9共計10個不同clade。其中clade 2.3.4最早于2003~2006年間流行于中國、越南、泰國、老撾和馬來西亞等地的病毒株，2006~2009年clade 2.3.4分支在我國很多地區(qū)是優(yōu)勢流行株；而2010年后雖然逐漸被clade 2.3.2分支取代，但是clade2.3.4分支依然在我國很多地區(qū)流行著。近年來， clade 7.2 H5亞型高致病性禽流感病毒也在部分地區(qū)流行，對clade 2.3.4和clade 7.2 H5亞型高致病性禽流感病毒進行鑒別診斷尤為重要。針對clade 2.3.4 H5 AIV的疫苗（Re-5株）和clade 7.2 H5 AIV的疫苗（Re-7株）已研制成功，對clade 2.3.4和clade 7.2 H5 AIV進行鑒別診斷有助于指導(dǎo)H5 AIV相應(yīng)疫苗的科學(xué)使用。

然而，clade 2.3.4和clade 7.2二者之間的HA基因序列同源率高達(dá)92.7%（以經(jīng)典參考毒株比較為例），很難通過常規(guī)的分子生物學(xué)方法進行鑒別。

本發(fā)明的一組區(qū)分clade2.3.4和clade7.2 H5 AIV的實時熒光定量PCR引物僅需1組引物對（2條引物）即可有效對clade2.3.4和clade7.2 H5 AIV進行有效區(qū)分。該引物根據(jù)clade2.3.4和clade7.2 H5 AIV血凝素基因（HA）所存在的特征性核苷酸序列差異來設(shè)計；利用實時熒光定量PCR反應(yīng)后生成的熔解曲線的Tm值和其GC含量正相關(guān)的特點，通過觀察clade2.3.4和clade7.2 H5 AIV經(jīng)該組引物進行實時熒光定量PCR擴增反應(yīng)后的熔解曲線Tm值差異，即可精確對clade2.3.4和clade7.2 H5 AIV感染情況進行準(zhǔn)確鑒別診斷，相關(guān)研究尚未見國內(nèi)外文獻報道，本發(fā)明可填補相關(guān)領(lǐng)域空白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一組區(qū)分clade2.3.4和clade7.2 H5 AIV的實時熒光定量PCR引物及其應(yīng)用，該引物能有效區(qū)分clade2.3.4和clade7.2 H5 AIV感染（或共感染），為科學(xué)防控 H5 AIV提供技術(shù)保證。