[發(fā)明專利]一種T2毒素適配體親和柱及其制備方法和用途

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710028007.8
• 申請日: 2017-01-16
• 公開（公告）號: CN107063820A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張彥明
• 申請（專利權(quán)）人: 北京美正生物科技有限公司
• 主分類號: G01N1/34
• 分類號: G01N1/34;B01D15/22;B01D15/38
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種T2毒素的適配體親和柱及其制備方法和用途，屬食品安全檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)

毒素是由多種真菌，主要是三線鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族化合物(trichothecenes，TS)之一。它廣泛分布于自然界，是常見的污染田間作物和庫存谷物的主要毒素，對人、畜危害較大。T-2毒素為白色針狀結(jié)晶，在室溫條件下相當(dāng)穩(wěn)定，放置6~7年或加熱至100~120℃ 1小時毒性不減。T-2毒素帶有酯基，用堿處理后水解成相應(yīng)的醇。要使雙鍵還原可用接觸氫化。四氫鉀鋁或氫硼化鈉可使環(huán)氧基還原成醇。

毒素主要作用于細(xì)胞分裂旺盛的組織器官，如胸腺、骨髓、肝、脾、淋巴結(jié)、生殖腺及胃腸粘膜等，抑制這些器官細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA合成。此外，還發(fā)現(xiàn)該毒素可引起淋巴細(xì)胞中DNA單鏈的斷裂。T-2毒素還可作用于氧化磷酸化的多個部位而引起線粒體呼吸抑制。1973年聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAQ)和世界衛(wèi)生組織(WHO)在日內(nèi)瓦召開的聯(lián)席會議上，把這類毒素同黃曲霉素一樣作為自然存在的最危險的食品污染源。我國國標(biāo)GB 21693-2008規(guī)定，飼料中的T2毒素含量不能超過1000ug/kg。

目前T2毒素的檢測方法有薄層層析法、高效液相色譜法（HPLC）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。

其中薄層層析法是最早使用也是最廣泛使用的檢測T2毒素的方法，其優(yōu)點是適合于沒有經(jīng)過專門培訓(xùn)的人員操作,且成本低,無需價格昂貴的儀器,。但是薄層層析法對樣品處理繁瑣，實驗過程復(fù)雜，所需檢測周期較長，容易受到雜質(zhì)的干擾。測定時用目測半定量,主觀影響較大,靈敏度不高等,已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測要求。

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA ）檢測方法檢測特異、快速、靈敏度高、并且成本較低。成本低的特點,適用于基層機構(gòu)大量樣品的篩選和普查,可以大大節(jié)省時間和費用,因此越來越受到基層檢驗單位的歡迎。ELISA方法的主要問題是容易造成假陽性。因此主要用于基層的篩查檢測。

高效液相色譜法( HPLC)具有準(zhǔn)確度高、靈敏性強、可微量測定等優(yōu)點,是目前常用于食品中毒素檢測的方法。但因其對樣品中毒素純度的要求較高,導(dǎo)致檢測成本高、周期長,無法滿足大批量樣品快速篩選的需要,所以使用受到限制。今年來發(fā)展起來的免疫親和柱-高效液相色譜（IAC-HPLC)）將免疫親和純化技術(shù)與高效液相色譜相結(jié)合。使HPLC的使用更加廣泛。免疫親和柱作為一種新的凈化技術(shù),在真菌毒素的分析檢測中應(yīng)用越來越廣泛。它是將特異性抗體結(jié)合到活化的固相載體上填充而成。當(dāng)樣品提取液通過柱子時,其中的抗原與抗體結(jié)合,其他雜質(zhì)則通過水溶液洗掉,再用有機溶劑將抗原即毒素洗脫下來,從而使樣品中的毒素得以凈化。

免疫親和柱具有操作簡單，特異性高的優(yōu)點。但是由于抗體獲得困難，免疫親和柱通常比較昂貴。并且由于抗體本身是一種蛋白質(zhì)，其活性受到周圍環(huán)境的影響。保存不當(dāng)或者操作不當(dāng)很容易造成抗體失活從而影響免疫親和柱的效率。

適配體是一段核酸序列，通常為DNA或者RNA序列。單鏈的核酸序列可以形成二級結(jié)構(gòu)，從而能與靶點特異性結(jié)合。通過多次的富集和篩選，能夠篩選到與靶點有高親和力的特異性適配體。Herman等描述了核酸適配體的結(jié)合特異性，[Science 287,820-825].核酸適配體相對于抗體來說更穩(wěn)定，不易受到環(huán)境的影響，并且核酸適配體可以化學(xué)合成，保證序列的準(zhǔn)確性。[Song. Trends Analy. Chem 2008.27(2)]。

核酸適配體被應(yīng)用于小分子的檢測，在專利CN103808701 A中描述了一種基于赭曲霉毒素的核酸適配體熒光嵌合染料檢測赭曲霉毒素的方法，利用赭曲霉毒素的核酸適配體與互補序列形成一個檢測元件，利用嵌合染料作為報告分子檢測樣本中的赭曲霉毒素。在專利CN102735704A中，描繪了一種赭曲霉毒素的電化學(xué)傳感器，利用赭曲霉毒素的適配體包被在裸金電極上，制備電化學(xué)傳感器，用于檢測赭曲霉毒素。在專利CN105372213A中，描述了一種利用赭曲霉毒素適配體檢測方法，將赭曲霉毒素的適配體用上轉(zhuǎn)發(fā)光材料標(biāo)記，利用上轉(zhuǎn)發(fā)光材料的熒光能量轉(zhuǎn)移特性進(jìn)行檢測。

基于核酸適配體的檢測方法很多，但是凈化和純化方法較少。在專利CN104399283中，描述了一種黃曲霉毒素B1的適配體親和柱。該專利利用環(huán)氧基活化的瓊脂糖微球，將黃曲霉毒素B1的適配體偶聯(lián)，制備成親和柱。實現(xiàn)黃曲霉毒素的分離。

發(fā)明內(nèi)容