[發(fā)明專利]MT基因作為防治AFB1致鴨肝臟損傷靶標基因的應用

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• 申請日: 2017-01-13
• 公開（公告）號: CN106860878A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發(fā)明（設計）人: 孫鋁輝;張妮婭;齊德生;高鑫;趙玲
• 申請（專利權）人: 華中農業(yè)大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A23K50/75;A61P1/16
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司42104
• 代理人: 樊戎,馮超

技術領域

本發(fā)明涉及MT基因的新用途，具體地指MT基因作為防治AFB1致鴨肝臟損傷靶標基因的應用。

背景技術

飼料中黃曲霉毒素B₁(aflatoxin B₁,AFB₁)污染普遍存在，嚴重損害動物的健康，降低動物的生產性能，并造成畜產品中黃曲霉毒素的殘留，給畜產品的食用安全帶來極大隱患。雛鴨是常見畜禽中對AFB₁最敏感的物種之一。動物經口攝入AFB₁后主要蓄積與肝臟，同時，肝臟也是生物活化AFB₁為高毒性AFB₁-外8,9-環(huán)氧化物(AFBO)的場所，是AFB₁危害的主要靶器官，且雛鴨的肝臟損傷具有典型的病理學變化特征。因此，雛鴨原代肝細胞是研究AFB₁毒性的理想模型。DNA被AFBO烷基化形成AFB₁-8,9-二氫二醇，導致了G→T的突變，被認為是AFB₁引起的主要突變(Bedard and Massey,2006)。此外，AFB₁還能誘導肝臟產生活性氧自由基(ROS)，如超氧陰離子自由基、過氧化氫和脂質過氧化物，它們是羥基自由基的前體物質(Halliwell and Gutteridge,1999)，而羥基自由基能攻擊DNA上的糖、嘧啶以及嘌呤，而引起DNA氧化損傷，甚至突變(Bedard and Massey,2006)。然而，有限的研究發(fā)現，AFB₁誘導ROS的形成，需要細胞色素P450酶(CYP450)催化形成的AFBO和/或水解產生的AFM₁的參與外，還同時需要鐵離子參與催化過程和Kupffers細胞的參與(Shen et al.,1996；Towner et al.,2003)。但是，目前關于AFB₁引起的氧化應激導致肝臟損傷的機制尚不清楚。

AFB₁致鴨肝臟損傷與其誘導機體抗氧化能力損傷有關。鴨AFB₁中毒造成的肝臟損傷尚無有效的治療或緩解方法，主要原因在于哪些關鍵基因參與AFB₁誘導鴨肝臟毒性尚不清楚。

發(fā)明內容

本發(fā)明針對現有技術對防治AFB₁致家禽肝臟毒性的不足，提供了一種MT基因(金屬硫蛋白基因)作為防治AFB₁致動物肝臟損傷靶標基因的應用。

為了實現上述目的，本發(fā)明提供了一種MT基因作為防治AFB₁致動物肝臟損傷靶標基因的應用，所述MT基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

所述MT基因的編碼金屬硫蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

金屬硫蛋白(metallothionein,MT)的分子功能主要是結合金屬離子，在重金屬脫毒反應中發(fā)揮重要作用(Margoshes and Vallee,1957)，同時，越來越多的研究揭示了MT能緩解氧化應激、致癌原對機體的損傷(Shibuya et al.,2008；Fujiwara and Satoh,2013)、參與細胞凋亡。MT1/2敲除小鼠對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和LPS/半乳糖胺極敏感，動物接觸后表現為急性肝功能衰竭(Kimura et al.,2001；Inoue et al.,2006)。

本發(fā)明運用鴨原代肝細胞為模型，通過鴨原代肝細胞過表達MT基因，檢測MT基因在調控AFB₁致鴨肝臟毒性作用中的功能。通過MTT試驗、細胞凋亡試驗、Western blotting和q-PCR技術，以及檢測鴨原代肝細胞內抗氧化能力相關指標和肝細胞中AFBO-DNA含量的變化情況，結果表明MT能有效抑制AFB₁致雛鴨肝臟原代細胞損傷的功能，主要通過增強細胞的抗氧化能力、減少AFBO-DNA的生成、及調控抑癌因子和促凋亡相關基因的表達，進而抑制AFB₁誘導的肝細胞癌變和凋亡。說明了MT基因在抑制AFB₁毒性上作用。

通過上述研究發(fā)現，AFB₁誘導雛鴨肝臟毒性過程中，能極顯著下調MT基因的表達，而鴨原代肝細胞過表達MT可極顯著抑制AFB₁致肝細胞毒性。因此，確定MT基因在AFB₁致雛鴨肝臟損傷中起到關鍵作用。