[發(fā)明專利]采用SCoT分子標(biāo)記簡化箭筈豌豆品種純度鑒定的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710025421.3
• 申請日: 2017-01-13
• 公開（公告）號: CN107058494B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 閆龍鳳;柴旭田
• 申請（專利權(quán)）人: 蘭州大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責(zé)任公司 62102
• 代理人: 張真

1.一種采用SCoT分子標(biāo)記簡化箭筈豌豆品種純度的鑒定方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)箭筈豌豆種質(zhì)DNA提?。弘S機取樣，采用改進后的CTAB法提取待測種質(zhì)基因組DNA備用；

(2)采用SCoT引物對步驟(1)的箭筈豌豆種質(zhì)DNA進行PCR擴增，其中PCR擴增反應(yīng)的總體積是10μl，擴增反應(yīng)體系為：2×Power Taq PCR Master Mix 5.0μl，SCoT引物分別為1μl，包括Scot28引物：5'-CCATGGCTACCACCGCCA-3'為1μl；

Scot35引物：5'-CATGGCTACCACCGGCCC-3'為1μl'；

Scot36引物：5'-GCAACAATGGCTACCACC-3'為1μl；

Scot37引物：5'-ACGACATGGCGACCAGCG-3'為1μl；

Scot38引物：5'-ACGACATGGCGACCACCG-3為1μl，步驟(1)箭筈豌豆種質(zhì)DNA 50ng/μl，2.0μl，ddH₂0 2μl；PCR擴增反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性4min；35個擴增循環(huán)：94℃變性1min，退火1min，72℃延伸2min；72℃延伸7min；4℃保存；

(3)對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度為1.2-1.4％，凝膠組分為瓊脂糖6.1-7.1g，ddH20 450ml，10×TBE 50ml，核酸染料9-12μl；跑膠電壓129-132V，電泳時間2h15min-2h30min，關(guān)閉電源，用化學(xué)凝膠成像儀照相；

(4)比較箭筈豌豆種質(zhì)多態(tài)性位點的差異，確定箭筈豌豆品種純度鑒定結(jié)果，箭筈豌豆種質(zhì)平均多態(tài)性位點為21.4-27.4，通過統(tǒng)計0,1矩陣，統(tǒng)計等位基因數(shù)，計算觀測雜合度，觀測雜合度(Ho)＝觀察得到雜和個體數(shù)/樣本個體數(shù)總數(shù)，Ho均為100％，所統(tǒng)計位點均為多態(tài)性位點，等位基因保留比例大于85％可代表該種質(zhì)大部分遺傳信息,品種純度為合格。

2.如權(quán)利要求1所述的采用SCoT分子標(biāo)記簡化箭筈豌豆品種純度的鑒定方法，其特征在于步驟(4)還包括確定引物的等位基因數(shù)，按照對應(yīng)待測品種的PCR擴增產(chǎn)物片段大小統(tǒng)計0,1矩陣，得到相應(yīng)等位基因數(shù)，根據(jù)統(tǒng)計的等位基因按計算公式計算多態(tài)信息含量PIC，其中：n為等位基因數(shù)目；P_i和P_j分別為第i和第j個等位基因的頻率；在相同遷移位置上進行“0,1”統(tǒng)計，構(gòu)建箭筈豌豆種質(zhì)的SCoT分析譜帶數(shù)據(jù)，通過數(shù)據(jù)分析所用引物是否對箭筈豌豆種質(zhì)進行完全區(qū)分。

3.如權(quán)利要求1所述的采用SCoT分子標(biāo)記簡化箭筈豌豆品種純度的鑒定方法，其特征在于還包括所述的每個箭筈豌豆種質(zhì)最佳取樣數(shù)為10個單株。