[發明專利]一種原位雜交探針及其對大麥染色體組鑒定的方法

有效

• 申請號: 201710021330.2
• 申請日: 2017-01-11
• 公開（公告）號: CN106636424B
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發明（設計）人: 陳光登;胡德益;李廷軒;張錫洲;王永東;鄭子成;余海英;康亮珠
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6841;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

本發明提供了一種原位雜交探針及其對大麥染色體組鑒定的方法，本發明的原位雜交探針Oligo?442A01可用于標記大麥染色體，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，并對該核苷酸進行熒光標記用于構建探針。利用該探針與(AGG)₅組成的探針組合在不需進行染色體變性的條件下，能有效識別大麥染色體組，是一種較好的識別、區分大麥染色體組的探針組合方法。本發明提供的探針及方法能準確地標記與識別大麥染色體組，對分析大麥染色體形態及行為具有較好效果，在大麥分子細胞學及染色體工程育種領域具有良好的應用前景。

技術領域

本發明涉及分子細胞遺傳學領域，特別是涉及大麥染色體原位雜交(FISH)過程中寡核苷酸的確定與應用，本發明還涉及利用本發明提供的寡核苷酸探針對大麥開展非變性熒光原位雜交(ND-FISH)反應體系的建立與對大麥染色體組鑒定的應用。

背景技術

高等生物染色體復結構雜，在不同染色體區域存在大量的重復序列，基于這一特性，在分子細胞遺傳學領域通常通過標記重復序列用于鑒定染色體。其是通過對重復序列進行熒光標記標記制備探針，使用染色體原位雜交方法分析染色體上探針信號的分布狀態，從而區分基因組與染色體組。此外，通過比較染色體上探針信號的變化亦是分析染色體行為的普遍做法。進一步地，染色體原位雜交方法在染色體工程育種中也起著至關重要的作用，染色體原位雜交方法是鑒定、區分特定物種基因組與染色體組最有效、直接的方法之一。

目前，已經報道的大麥亞端粒探針僅有Hv01，其是通過擴增大麥基因組亞端粒重復序列而得到的(Schubert et al.The Plant Journal 1998,14:494)。然而，通過標記擴增目標序列流程復雜，耗時費力，且受多種因素影響使得標記效果往往不理想。尤其是在進行大量試驗操作時，這一方法將在很大程度上影響試驗進程與效果。同時，通過標記擴增目標序列開展染色體原位雜交實驗的方法需要對目標材料染色體進行變性處理，不僅增加了試驗流程，同時在處理過程中易對載玻片上的染色體位置產生位移。當前，ND-FISH技術逐步興起，替代傳統的FISH試驗方法。其可通過設計合適的寡合苷酸探針，在不變性的條件下直接對目標材料染色體進行標記，極大地精簡了實驗步驟、縮短了試驗時間，同時保證了試驗效果。因此，提供一條能穩定標記大麥亞端粒區域的核苷酸探針將有助于解決當前原位雜交試驗中標記大麥亞端粒區域所面臨的困境。

發明內容

為克服現有技術上的不足，本發明提供一種能穩定標記大麥染色體組的寡核苷酸探針以及該探針結合其他寡核苷酸探針通過ND-FISH方法鑒定大麥染色體組的應用。

基于以上目的，本發明根據Schubert et al.(The Plant Journal 1998,14:494)對大麥染色體亞端粒區的研究結果確定引物：

上游引物序列，5’-CGAAACTCGCATTTTGGCC-3’(HvT01-F)

下游引物序列，5’-AGAGTTCCCGTAACCGGCCC-3’(HvT01-R)，利用該引物對栽培大麥Baudin、野生大麥CN4027全基因組DNA進行PCR擴增反應，通過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現其產物存在如圖1所示的4條較亮條帶。選取其250bp左右條帶回收并構建質粒進行測序，結果顯示，其序列長度為113-116bp，說明所回收的核苷酸中存在兩個前后相連的相似性極高的片段。利用NCBI數據庫對測序結果Baudin 1進行序列比對分析，檢測出其在一段全長為105111bp序列HV_Mba442-A01(GenBank登錄號為AC256248.1)上存在64個拷貝。將HV_Mba442-A01分成小片段后反復在NCBI數據庫中與其自身比對，最終確定一段相對保守的全長為55bp的核苷酸用于探針制備，其堿基序列為：