[發明專利]一種重組人血管內皮抑制素生物活性檢測方法

有效

• 申請號: 201710019912.7
• 申請日: 2017-01-12
• 公開（公告）號: CN108303384B
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發明（設計）人: 姜桂香;劉珊珊;劉曉艷;陳倩潔;陳虹
• 申請（專利權）人: 山東先聲生物制藥有限公司;江蘇先聲藥業有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N33/535
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種重組人血管內皮抑制素生物活性的檢測方法，包括如下步驟:

(1)人臍靜脈血管內皮細胞傳代培養至對數生長期，胰酶消化后均勻懸浮，接種相同體積的細胞懸液至培養孔中；

(2)預估待測樣品的活性，將重組人血管內皮抑制素標準品和待測樣品稀釋至多個效價一致的濃度梯度點，向步驟(1)中的培養孔中加入相同體積的各濃度梯度點的重組人血管內皮抑制素標準品或待測樣品繼續培養；

(3)采用MTS染色法，測定培養孔中的OD值；

(4)按照量反應平行線法計算實驗結果，具體包含以下步驟：

a.差方和計算

K＝k+k，

差方和(總)＝Σy²-(Σy)²/mk；

f(總)＝mk-1；

差方和(劑間)＝Σ((Σy(k))²)/m-(Σy)²/mk；

f(劑間)＝k-1；

差方和(區組間)＝Σ((Σy(m))²)/k-(Σy)²/mk；

f(區組間)＝m-1；

差方和(誤差)＝差方和(總)-差方和(劑間)-差方和(區組間)；

f(誤差)＝(m-1)×(k-1)；

S²＝差方和(誤差)/f(誤差)；

其中，m為平行線測定法各劑量組內反應的個數；k為S和T的劑量組數和；f為自由度；S為標準品；T為供試品；y為測定的OD值，Σy(k)為S和T各劑量組反應值之和；Σy(m)為S和T各劑量組內各區組反應值之和；

b.可靠性測驗；

c.效價及可信限計算：

g＝t²s²m/4W²；

R＝D×antilg(IV/W)；

S_M＝{I/〔W²(1-g)〕}{ms²〔(1-g)AW²+BV²〕}0.5；

R的FL＝antilg(lgR/(1-g)±t*S_M)；

A_T(估計效價)；

P_T的FL＝AT*R的FL；

P_T的FL％；

P_T＝A_T*R；

其中r為S和T相鄰高低劑量的比值；I為相鄰高低劑量比值的對數，I＝lgr；V、W、均為平行線測定效價計算用數值；D為效價計算用數值；R為S和T的等反應劑量比值；M為效價比值(R)的對數；S_M為M的標準誤；A、B均為S_M計算公式中的數值；t為可信限計算用t值；g為回歸的顯著性系數；P_T為供試品T的測得效價。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述培養條件為在37℃，5％CO2的培養箱中培養。

3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟(1)中所述人臍靜脈血管內皮細胞傳代培養至對數生長期，具體為人臍靜脈血管內皮細胞傳代培養至3～5代。

4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟(1)中所述向培養孔中接種相同體積的細胞懸液，具體為向培養孔中接種密度為4000-6000個/ml的細胞懸液；接種體積為160μl-180μl；培養孔為96孔板中的培養孔。

5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于步驟(1)中所述向培養孔中接種相同體積的細胞懸液，具體為向培養孔中接種密度為5000個/ml的細胞懸液；接種體積為160μl。

6.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟(2)中所述的繼續培養的時間為3-5天。

7.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟(2)中所述的濃度梯度點為2-4個。