[發明專利]一種制備自噬小體型瘤苗的培養基添加劑及其制備方法

在審

• 申請號: 201710018536.X
• 申請日: 2017-01-10
• 公開（公告）號: CN106635994A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 何向鋒;肖忠黨;沈康;胡飛虎;朱延亮;金華;曹新江;王俊華;司珂;葉正
• 申請（專利權）人: 東南大學;南通市腫瘤醫院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙)11400
• 代理人: 高之波,倪金磊

技術領域

本發明涉及醫藥技術領域，尤其是一種用于制備自噬小體型亞細胞腫瘤疫苗的細胞培養基添加劑凍干粉及其制備方法。

背景技術

腫瘤細胞代謝產生的蛋白可分為長壽命蛋白和短壽命蛋白兩大類，前者平均半衰期長，結構穩定，主要通過自噬-溶酶體途徑降解；后者平均半衰期短，主要通過泛素-蛋白酶體途徑降解。研究表明，腫瘤細胞直接遞呈的抗原多肽有80％以上來源于短壽命蛋白，而短壽命蛋白由于其半衰期極短難以保存下來。對腫瘤細胞應用蛋白酶體抑制劑阻斷腫瘤短壽命蛋白的降解，促使其進入自噬途徑，同時采用自噬誘導劑促進自噬小體形成，并以弱堿性藥物抑制溶酶體功能，阻止溶酶體對自噬小體中蛋白的降解。在此基礎上，收集富含短壽命蛋白信息的自噬小體，可作為腫瘤疫苗，即自噬小體型亞細胞腫瘤疫苗。

蛋白酶體抑制劑的代表藥物為硼替佐米，其通過結合蛋白酶體20S催化亞單位的不同位點，能選擇性地抑制一些特定蛋白的降解，使得細胞周期不能有序地進行。硼替佐米對蛋白酶體的抑制作用是可逆的，在經過72小時處理后大多數蛋白酶體的活性都可以恢復正常。泛素化的靶蛋白(包括錯誤翻譯、錯誤折疊、突變或變性的蛋白等)除能夠通過泛素-蛋白酶體途徑得以降解外，還能與p62蛋白C端的的泛素相關結構域發生結合，并通過p62蛋白N端的Bem 1結構域發生自我聚集；該聚集體能通過p62蛋白上的LRS/LIR結構域與LC3結合并形成復合物、并由LC3介導形成自噬小體，最后自噬小體與溶酶體融合完成蛋白的降解。

弱堿性藥物氯化銨(Ammonium chloride)、氯喹(Chloroquine，CQ)、羥氯喹(Hydroxychloroquine，HCQ)等可靶向濃集于溶酶體，通過上調溶酶體內pH值，抑制溶酶體相關酸性水解酶的活性，阻斷溶酶體對自噬體的代謝。巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1)是液泡型H+-ATPase(Vacular H+-ATPase，V-ATPase)抑制劑，通過抑制溶酶體膜上的V-ATPase活性，阻止H+由細胞質向溶酶體內的跨膜轉運，影響溶酶體的酸化，抑制溶酶體的功能，阻斷溶酶體對自噬體的胞內消化作用。氯喹口服后，腸道吸收快而充分，服藥后l-2小時血藥濃度達峰值，約55％的藥物在血中與血漿成分結合，血藥濃度維持較久，半衰期為2.5-10天。氯喹在肝、脾、腎、肺中的濃度高于血漿濃度達200-700倍。溶酶體內的pH為酸性，有利于弱堿性藥物氯喹的濃集，濃集的氯喹消耗了溶酶體內的H+，因此可提高溶酶體內的pH，抑制溶酶體內酸性水解酶的活性，而自噬體和溶酶體的融合及融合后被溶酶體內的酸性水解酶降解是自噬代謝途徑的關建環節，因此氯喹具有靶向抑制自噬的作用。

自噬(Autophagy)，又稱Ⅱ型程序性細胞死亡，是廣泛存在于真核細胞中的生命現象，包括大自噬(Macroautophagy)、小自噬(Microautophagy)和分子伴侶介導的自噬(Chaperone-mediated autophagy)三種形式。自噬參與調控細胞的發育、分化、成分更新及組織重塑等生理過程，對維持蛋白質代謝平衡及細胞內環境穩定具有重要意義。自噬表現為細胞質中出現大量包裹著細胞質和細胞器的雙層膜囊泡結構，即自噬體(Autophagosome)，其與溶酶體融合形成自噬溶酶體，通過溶酶體水解酶降解囊泡內的物質和內層膜而發揮自噬作用。微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associatedprotein 1 light chain 3，MAP1-LC3，LC3)是目前觀察自噬現象是否存在、研究自噬活性較為可靠的生物學標志物。細胞自噬未發生時，LC3經過加工成為胞漿可溶性LC3Ⅰ。細胞發生自噬時，細胞內LC3的含量及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化均明顯增加。因此LC3-Ⅱ的含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例與自噬泡的數量呈正相關，在某種程度上反映了細胞的自噬活性。

細胞內有兩條信號通路與自噬調控有關：

1、依賴mTOR途徑的信號通路

絲氨酸-蘇氨酸激酶(mTOR)是主要的自噬負性調節器。mTOR的活性取決于多種上游信號的輸入，這些上游信號包括能量狀態、營養狀態、氨基酸和生長因子等。當營養缺乏、生長因子信號減弱以及ATP濃度減少時，mTOR都會被抑制。因此在饑餓時，mTOR被抑制，其抑制自噬體形成的作用也解除了，因此自噬體的生產就會增多。自噬誘導劑雷帕霉素是一種親脂的大環內酯類抗生素，可通過抑制mTOR的活性來誘導自噬。

2、非mTOR依賴的信號通路