[發(fā)明專利]一種牛PDHB基因腺病毒干擾載體構(gòu)建及其鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710018350.4
• 申請日: 2017-01-11
• 公開（公告）號: CN106811484B
• 公開（公告）日: 2020-03-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李安寧;昝林森;武麗娟;王曉宇
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/66;C12N15/113
• 代理公司: 西安長和專利代理有限公司 61227
• 代理人: 黃偉洪

1.一種牛PDHB基因腺病毒干擾載體，其特征在于，所述牛PDHB基因腺病毒干擾載體的shRNA序列為：SEQ ID NO：2。

2.一種如權(quán)利要求1所述牛PDHB基因腺病毒干擾載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述牛PDHB基因腺病毒干擾載體的構(gòu)建方法包括以下步驟：

步驟一，載體用BamH I，EcoR I雙酶切；

步驟二，酶切完成后膠回收；

步驟三，目的片斷利用3’和5’的單鏈退火獲得：

步驟四，處理好的目的片段與載體連接反應(yīng)；

步驟五，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞:DH5a；

步驟六，轉(zhuǎn)化后的B-PDHB shRNA平板挑菌，37℃250轉(zhuǎn)/分鐘搖菌14小時，將菌液送測序公司測序。

3.如權(quán)利要求2所述的牛PDHB基因腺病毒干擾載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述酶切體系如下：

4.如權(quán)利要求2所述的牛PDHB基因腺病毒干擾載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述酶切完成后膠回收具體包括：

1)DNA電泳結(jié)束后，用潔凈刀片在紫外線燈下切出相應(yīng)片段；

2)含DNA的瓊脂糖膠塊裝入1.5ml離心管，估算其體積；加入500μl(<150μl凝膠)或3～4倍(>150μl凝膠)凝膠體積的Buffer PS溶膠結(jié)合液；

3)離心管置于50℃～60℃水浴5～10min，每隔2～3min取出混懸震蕩10sec，至瓊脂糖凝膠完全溶解，室溫放置5min冷卻；

4)將少于700μl融化膠液轉(zhuǎn)移至插入套管的離心柱內(nèi)，于臺式離心機上高速離心1min，棄去套管內(nèi)廢液，再將離心柱插入套管；

5)多于700μl的剩余融化膠液，加入同一離心柱內(nèi)，重復(fù)步驟4)；

6)向離心柱內(nèi)加入Buffer PW洗滌液)700μl，高速離心1min，棄去套管內(nèi)廢液，將離心柱插入套管；

7)高速離心1～2min后，取出離心柱，棄去套管；

8)將離心柱插入一個新的1.5ml離心管，在離心柱內(nèi)硅膠膜中心位置加入30～50μlElution Buffer洗脫液；室溫放置2～5min，高速離心1min，離心管中即得純化的DNA溶液；

9)獲得的DNA溶液，可直接應(yīng)用于后續(xù)實驗中，或保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

5.如權(quán)利要求2所述的牛PDHB基因腺病毒干擾載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述目的片斷利用3’和5’的單鏈退火獲得包括：

體系：20ul

10X Buffer：2ul；

100mM Tris-cl pH7.5；

1M NaCl；

10mM EDTA；

shDNA-R/shDNA-F：1/1ul；

H2O：16ul；

退火程序：

95℃ 10分鐘；

75℃ 10分鐘；

55℃ 10分鐘；

35℃ 10分鐘；

15℃ 10分鐘。

6.如權(quán)利要求2所述的牛PDHB基因腺病毒干擾載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞:DH5a具體包括：

1)吸取連接產(chǎn)物(體積≤10uL)于50-100uL感受態(tài)細(xì)胞中，混合均勻，在冰上放置30min；

2)將離心管放到42℃水浴中，熱激90s，取出后迅速放于冰上，冷卻1-2min；

3)向離心管中加入5倍體積的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45-60min；

4)8,000rpm離心30s，去部分上清，留100uL左右培養(yǎng)液，移液槍吸打均勻后，用三角涂布棒涂布在選擇性LB平板上；

5)倒置培養(yǎng)皿于37℃培養(yǎng)12-16h，待單菌落長出后，挑取單菌落。