[發(fā)明專利]用于檢測產(chǎn)超廣譜β?內(nèi)酰胺酶三種細菌耐藥基因的LAMP引物組合及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710017456.2
• 申請日: 2017-01-11
• 公開（公告）號: CN106754907A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張巖;劉瑩瑩;王顥婷;邢婉麗;程京
• 申請（專利權(quán)）人: 博奧生物集團有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11245
• 代理人: 關(guān)暢,任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中，用于檢測產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶三種細菌耐藥基因的LAMP引物組合及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

抗菌藥物是臨床應(yīng)用最廣泛的一類藥物，但近年感染性疾病的病死率迅速提升，究其原因在于抗生素濫用，耐藥菌帶來的用藥困難。我國是抗生素濫用情況最為嚴重的國家之一，然而隨著抗生素使用量的加大，細菌耐藥情況也越發(fā)嚴重。

抗生素種類繁多，作用機制多樣，其中β-內(nèi)酰胺類抗生素是指其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類，包括青霉素類、頭孢菌素類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、單環(huán)內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類等，可通過結(jié)合在青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)上，從而破壞細菌細胞壁合成已達到抑菌滅菌的目的。

細菌產(chǎn)生耐藥性的原因很多，主要分為產(chǎn)生滅活酶、抗菌藥物作用靶位改變、改變細菌外膜通透性、影響主動泵出系統(tǒng)、影響細菌被膜的形成及交叉耐藥性等六方面。

部分細菌可產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，即細菌產(chǎn)生的能水解β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的滅活酶，它是細菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要機制。根據(jù)《產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細菌感染防治專家共識》中所述，其中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-Sperctrumβ-Lactamases,ESBLs)是一類主要由大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌等腸桿菌科細菌由于體內(nèi)相關(guān)耐藥基因的存在，而產(chǎn)生的一類耐藥形式。即細菌在持續(xù)的各種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的選擇壓力下，被誘導(dǎo)產(chǎn)生的及不斷變異的β-內(nèi)酰胺酶，它擴展了其耐受頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟等第3代及第4帶頭孢菌素，以及氨曲南等單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的能力。

目前關(guān)于對細菌耐藥性的檢測主要有以下幾種方法：細菌耐藥表型的檢測(包括耐藥篩選試驗、折點敏感試驗及藥敏試驗的儀器化和自動化等)，β-內(nèi)酰胺酶檢測，特殊耐藥菌檢測和耐藥基因檢測等。其中最為直觀的檢測方法是以體外培養(yǎng)的藥物檢測，但仍存在培養(yǎng)時間長等缺陷。隨著耐藥機理的研究逐步深入，分子生物學(xué)方法檢測細菌耐藥逐漸被臨床接受。常見檢測細菌耐藥基因的方法主要有：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)、生物芯片技術(shù)(gene chip)、自動DNA測序(DNA sequencing)等。傳統(tǒng)的基因鑒定方法為PCR法和DNA測序法，其中傳統(tǒng)的PCR法檢測周期較長，通常需要3-4個小時；SangerDNA測序法對引物特異性要求較高，且價格較昂貴，后期數(shù)據(jù)分析較復(fù)雜，不適合臨床推廣使用。近年新發(fā)展起來的核酸等溫擴增技術(shù)，無論是在反應(yīng)時間還是儀器要求方面，都比PCR技術(shù)更有優(yōu)勢。在這些眾多等溫擴增技術(shù)中，又以環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)的應(yīng)用最為成熟、最為廣泛，其高靈敏度、高特異性、快速的擴增得到了市場的檢驗和認可。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測產(chǎn)ESBL酶的三種耐藥基因LAMP引物組合及其應(yīng)用。

本發(fā)明首先提供了一種引物組合，為如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由引物組Ⅰ、引物組Ⅱ和引物組Ⅲ組成；

(a2)由所述引物組Ⅰ、所述引物組Ⅱ和所述引物組Ⅲ中的任意兩個組成；

(a3)所述引物組Ⅰ、所述引物組Ⅱ或所述引物組Ⅲ；

所述引物組Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB組成；

所述引物Ⅰ-F3為如下(b1)或(b2)；

(b1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；

(b2)將序列1經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-B3為如下(b3)或(b4)；

(b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

(b4)將序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-FIP為如下(b5)或(b6)；

(b5)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；

(b6)將序列3經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-BIP為如下(b7)或(b8)；

(b7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；

(b8)將序列4經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-LF為如下(b9)或(b10)；