[發明專利]一種改造的熱穩定無機焦磷酸酶

有效

• 申請號: 201710017276.4
• 申請日: 2017-01-10
• 公開（公告）號: CN106834249B
• 公開（公告）日: 2019-11-29
• 發明（設計）人: 張曉瑋;彭春梅;鄧可基;李家導;張嘉;李海茵;陳鳳英;樂小炎;林志豪;林敏深;林若琳;謝麗娟;羅園香;石壯壯;王法;王星;張新;莫靜嫣;陳觀芝
• 申請（專利權）人: 廣州海力特生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14
• 代理公司: 44205 廣州嘉權專利商標事務所有限公司
• 代理人: 許飛<國際申請>=<國際公布>=<進入國

本發明公開了一種熱穩定無機焦磷酸酶，其特征在于，所述焦磷酸酶是由序列為SEQ ID NO:1的無機焦磷酸酶改造而來，其改造方法為下述方法中的至少一種：1）將第6位氨基酸T改造為氨基酸S；2）將第11位氨基酸E改為氨基酸K；3）將第72位氨基酸L改為氨基酸I；4）將第73位氨基酸V改為氨基酸I；5）將第124位氨基酸D改造為氨基酸A；6）將第160位氨基酸A改造為Q或K。經過改造以后，獲得的無機焦磷酸酶具有更高的擴增效率，熱穩定性也更好。

技術領域

本發明涉及酶的改造，特別涉及一種熱穩定無機焦磷酸酶的改造。

背景技術

在生物體內，NTPs/dNTPs參與核酸的生物合成會生成副產物焦磷酸鹽，體內存在的焦磷酸鹽會在焦磷酸酶的催化作用下分解，減少焦磷酸累積可能造成的負面效應。PCR利用嗜熱酶模擬體內核酸復制的體外反應，伴隨dNTPs的參入，焦磷酸的累積同樣會降低PCR擴增的效率。

焦磷酸的積累，會導致反應混合物的pH降低，影響熒光染料的穩定性(羅氏，200510099911.5)。為了去除這些焦磷酸對PCR的抑制，人們在PCR反應中添加無機焦磷酸酶，用以將焦磷酸(PPi)會水解為正磷酸(Pi)。

這種反應，會使反應混合液的pH增加，并是的熒光染料變得更穩定。

為了適應PCR的高溫，這種焦磷酸酶必須能耐受95℃的高溫。

趙丹彤等人重組表達了超嗜熱古菌(Pyrococcus horikoshii)的PPase基因(趙丹彤.重組超嗜熱無機焦磷酸酶的表達、純化及酶學性質研究[D].吉林大學,2003.)，這種酶最適溫度為88℃，最適pH為10.3，并不適合PCR的使用。

牟航等人重組表達了嗜熱棲熱菌(Thermus thermophiles)HB27株的PPase基因(牟航,夏勇,吳學強,等.耐熱無機焦磷酸酶的表達純化與性質研究[C]//全國酶學學術討論會暨鄒承魯誕辰85周年紀念會.2008.)，王磊等人重組表達了嗜熱棲熱菌HB8株的PPase基因。這種酶的最適溫度在65℃，最適pH為8.0，適合PCR的使用。然而這種酶的95℃下的半衰期僅20min，不足以滿足預變性時間較長，以及循環數較多的PCR反應。

由此，基于嗜熱棲熱菌的PPase基因，構建一種改造的熱穩定無機焦磷酸酶，這種酶可以應用于需要更多循環數以及反應時間的超敏PCR擴增，增加反應的擴增效率。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新的具有更高擴增效率的熱穩定無機焦磷酸酶。

本發明所采取的技術方案是：

一種熱穩定無機焦磷酸酶，由序列為SEQ ID NO:1的無機焦磷酸酶改造而來，其改造方法為下述方法中的至少一種：

1)將第6位氨基酸T改造為氨基酸S；

2)將第11位氨基酸E改為氨基酸K；

3)將第72位氨基酸L改為氨基酸I；

4)將第73位氨基酸V改為氨基酸I；

5)將第124位氨基酸D改造為氨基酸A；

6)將第160位氨基酸A改造為Q或K。

一種熱穩定無機焦磷酸酶，其序列為：