[發明專利]一種牛多殺性巴氏桿菌的環介導等溫擴增檢測引物組合物、檢測盒及其應用

在審

• 申請號: 201710017193.5
• 申請日: 2017-01-11
• 公開（公告）號: CN106755462A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 史鴻飛;闞云超;姚倫廣;唐存多;焦鑄錦;冷超糧;冀君;岳超;馬娜
• 申請（專利權）人: 南陽師范學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 鄭州知己知識產權代理有限公司41132
• 代理人: 朱廣存

1.一種牛多殺性巴氏桿菌的環介導等溫擴增檢測引物組合物，其特征在于：由正向內引物FIP、反向內引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3組成，其中，各引物的序列分別為：

FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，

BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，

F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，

B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。

2.如權利要求1所述的牛多殺性巴氏桿菌的環介導等溫擴增檢測引物組合物在檢測牛多殺性巴氏桿菌中的應用。

3.一種牛多殺性巴氏桿菌的環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于：包含檢測溶液，每24μL檢測溶液中包括：

10×Thermo Pol反應緩沖液 2.5μL

正向內引物FIP1.0μmol/L

反向內引物BIP1.0μmol/L

正向外引物F3 0.4μmol/L

反向外引物B3 0.4μmol/L

MgSO₄1.0mmol/L

dNTP 1.6nmol/L

Bst DNA聚合酶320000U/L

顯色試劑 3mmol/L

DEPC水 補足至24μL，

其中，各引物的序列分別為：

FIP：GCCACAAGCCAAATAAAAGACTACCAAATGGCATTATTTTATGGCTCG，

BIP：AGCACAGTTTTGTTGGGCAGAAAATAACGTCCAATCAGTTGC，

F3：CGCGAAATTGAGTTTTATGC，

B3：CAAGGAAATATAAACCGGCAA。

4.如權利要求3所述的牛多殺性巴氏桿菌的環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于：所述顯色試劑為羥基萘酚藍，在恒溫擴增反應前加入。

5.如權利要求3或4所述的牛多殺性巴氏桿菌的環介導等溫擴增檢測試劑盒在檢測牛多殺性巴氏桿菌中的應用。

6.利用如權利要求3或4所述的牛多殺性巴氏桿菌的環介導等溫擴增檢測試劑盒檢測牛多殺性巴氏桿菌的方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟S1：當原始病料樣品為液體樣本時，取所述液體樣本1mL在12000rpm/min條件下離心2min后起棄掉上清，再用PBS緩沖液1 mL重懸沉淀，12000rpm/min條件下離心2min后再次棄掉上清；然后利用100μL PBS緩沖液將沉淀吹懸后，取1μL作為樣品模板DNA；當原始病料樣品為固體樣本時，取所述固體樣品的病變與正常交界處的組織0.5g，加入10倍的PBS緩沖液無菌研磨，凍融2次后無菌紗布過濾，然后將獲得的濾液采用前述液體樣本的方法進行處理，得到樣品模板DNA；

步驟S2：取1μL的樣品模板DNA加入24μL所述環介導等溫擴增檢測試劑盒中的檢測溶液，62℃恒溫反應1小時；

步驟S3：觀察反應結束后溶液的顏色變化，陽性結果顯示為天藍色，陰性結果顯示為紫色。

7.如權利要求6所述的利用牛多殺性巴氏桿菌的環介導等溫擴增檢測試劑盒檢測牛多殺性巴氏桿菌的方法，其特征在于：所述樣品模板DNA，是疑似感染牛多殺性巴氏桿菌的患病動物組織樣品的基因組。