[發(fā)明專(zhuān)利]PlexinB2基因沉默的人肺癌穩(wěn)定細(xì)胞株及其構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710016881.X
• 申請(qǐng)日: 2017-01-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108265080A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-07-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳清勇;陳崢立;唐夏莉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第一一七醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/867
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種PlexinB2基因沉默的人肺癌穩(wěn)定細(xì)胞株及其構(gòu)建方法。該細(xì)胞株的建立是利用慢病毒載體將PlexinB2基因轉(zhuǎn)染入肺癌細(xì)胞，并經(jīng)藥物抗性篩選獲得PlexinB2基因沉默的穩(wěn)定細(xì)胞株。應(yīng)用細(xì)胞熒光顯微成像、Real?time PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞株P(guān)lexinB2的表達(dá)，證明細(xì)胞株構(gòu)建成功。本細(xì)胞株的建立為研究PlexinB2在肺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)分子機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)材料。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種PlexinB2基因沉默的人肺癌穩(wěn)定細(xì)胞株及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快、對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。肺癌的病因至今尚不完全明確，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是許多患者治療失敗和死亡的主要原因，因而揭示肺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，進(jìn)而預(yù)測(cè)肺癌的轉(zhuǎn)移潛能，對(duì)判斷預(yù)后和選擇合理而有效的治療方案、延長(zhǎng)患者的生存期和提高生活質(zhì)量等具有重要的意義。

神經(jīng)叢素(Plexins)是一個(gè)廣泛分布的跨膜受體家族，是信號(hào)素(Semaphorins)的受體，介導(dǎo)Semaphorins在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，分為4個(gè)亞家族：Plexin-A(1-4)、Plexin-B(1-3)、Plexin-C1和Plexin-D1。研究表明，Plexins在多種腫瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá)，有些Plexins高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。其中，Plexin-B2位于第22號(hào)染色體，包含37個(gè)編碼外顯子，有1838個(gè)氨基酸組成，為Sema4C的高親和力受體，可受肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF的介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)控而促進(jìn)細(xì)胞遷移。最近的研究顯示，在神經(jīng)元細(xì)胞中Plexin-B2與Rnd3表達(dá)可能是負(fù)相關(guān)的關(guān)系，Plexin-B2可通過(guò)激活RhoGEFs蛋白，在進(jìn)一步活化RhoA蛋白，從而促進(jìn)神經(jīng)元遷移，而Rnd3通過(guò)抑制RhoGAP激活，從而抑制RhoA蛋白活化，最終降低神經(jīng)元的遷移，同時(shí)Rnd3可能還受Plexin-B2負(fù)調(diào)控。在細(xì)胞骨架研究方面，Plexins通過(guò)與LARG和PDZ-RhoGEF結(jié)合可使Rho活化，在Plexins家族中只有Plexin B亞家族成員含有PDZ域結(jié)合位點(diǎn)，一些Semaphorins作用于Plexin B可以調(diào)控Rho，從而在軸突導(dǎo)向和細(xì)胞遷移時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白、整合素功能、細(xì)胞粘附等，這提示Plexin-B2可能在肺癌中也能起到微絲骨架調(diào)控作用。PAK1可能在多種信號(hào)通路中處于關(guān)鍵位置，是多種信號(hào)分子的下游靶蛋白，同時(shí)也是多種信號(hào)分子的上游調(diào)控蛋白，研究證實(shí)，PAK1可被多種生長(zhǎng)因子如HGF、IGF、PDGF、EGF等通過(guò)多種路徑激活。已有多項(xiàng)報(bào)道PAK1是Rho家族Cdc42和Rac1下游的重要靶蛋白，參與了細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)分化等生物學(xué)行為，提示它在信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中可能起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。此外，大量研究結(jié)果表明，激活的PAK1可通過(guò)下游效應(yīng)物的作用LIMK1/2、Cofilin促進(jìn)細(xì)胞骨架重構(gòu)和腫瘤細(xì)胞遷移，而失活的PAK1則引起相反的效應(yīng)。關(guān)于Plexin-B2在腫瘤中的研究尚少，其在肺癌中的作用尚不明確。我們以往的研究及其他文獻(xiàn)報(bào)道，PAK1/LIMK-1/微絲骨架蛋白在肺癌增殖、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重大作用。然而，Plexin-B2是否調(diào)控PAK1/LIMK-1/Cofilin通路并影響肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移，目前尚不清楚。我們前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)表明Plexin-B2在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，提示Plexin-B2可能參與肺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的調(diào)控。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道Plexin-B2功能研究主要采用表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法，其缺點(diǎn)是Plexin-B2的表達(dá)不穩(wěn)定、不持久。然而，慢病毒表達(dá)載體具有轉(zhuǎn)染效率高，用量少，能特異、持續(xù)、穩(wěn)定促進(jìn)目的基因表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)有技術(shù)中尚無(wú)持續(xù)、穩(wěn)定沉默Plexin-B2基因的人肺癌細(xì)胞株。本發(fā)明通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染得到的穩(wěn)定細(xì)胞株，為研究肺癌Plexin-B2/PAK1/LIMK-1/Cofilin信號(hào)通路與腫瘤轉(zhuǎn)移提供有力工具。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種PlexinB2基因沉默的人肺癌穩(wěn)定細(xì)胞株及其構(gòu)建方法，為研究肺癌PAK1/LIMK-1/Cofilin信號(hào)通路與腫瘤轉(zhuǎn)移提供有力工具。