[發(fā)明專利]一種DNA分子及其在生產(chǎn)鮭魚降鈣素中應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710015206.5
• 申請日: 2017-01-10
• 公開（公告）號: CN106591319B
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉昱輝;李梅;賈士榮;王志興
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N15/16
• 分類號: C12N15/16;C12N15/84;C12N1/21;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;何葉喧

本發(fā)明公開了一種DNA分子及其在生產(chǎn)鮭魚降鈣素中應(yīng)用。本發(fā)明所提供的DNA分子為序列表中序列1自5′末端起第22至120位核苷酸所示的DNA分子。實驗證明，將該DNA分子插入出發(fā)質(zhì)粒，得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化油菜品種中雙4號，得到轉(zhuǎn)基因植物；待轉(zhuǎn)基因植物成熟后收集種子，然后進(jìn)行繁育和PCR檢測，直至獲得純合種子。每10g純合種子可產(chǎn)生0.2mg鮭魚降鈣素。可見，本發(fā)明所提供的DNA分子可用于生產(chǎn)鮭魚降鈣素，具有重要的應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種DNA分子及其在生產(chǎn)鮭魚降鈣素中應(yīng)用。

背景技術(shù)

鮭魚降鈣素是由鮭魚后腮體分泌的由32個氨基酸組成的單鏈多肽。鮭魚降鈣素作為治療骨質(zhì)疏松癥等代謝性骨病的防治藥已被載入多國藥典，并已在多國行銷近30年。鮭魚降鈣素具有調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣、磷代謝及骨骼代謝的重要生物學(xué)功能，可降低血鈣水平，還具有抗組胺、抗膽堿、抑制胃酸和胰腺分泌的作用。臨床上主要用于治療骨質(zhì)疏松癥。鮭魚降鈣素的生產(chǎn)方法主要有提取法、化學(xué)合成法和基因工程法。提取法是以鮭魚、鰻魚的鰓為原料，提取獲得天然鮭魚降鈣素(生物學(xué)活性達(dá)到4500U/mg)，但由于原料有限，因此獲得的天然鮭魚降鈣素極少。基因工程法是在大腸桿菌或酵母中表達(dá)鮭魚降鈣素，但由于鮭魚降鈣素C端第32位氨基酸不能酰胺化，因此表達(dá)出的鮭魚降鈣素的生物學(xué)活性，僅為100-200U/mg。迄今為止，商業(yè)化銷售的鮭魚降鈣素都是采用化學(xué)合成法生產(chǎn)的，化學(xué)合成法步驟多、得率低且價格昂貴，注射針劑中的鮭魚降鈣素為12000元/mg，原藥價格也高達(dá)18000-20000元/g。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何制備鮭魚降鈣素。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種DNA分子。

本發(fā)明所提供的DNA分子，可為如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)具有序列表中序列1自5′末端起第22至120位核苷酸所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第22至120位所示的DNA分子；

b3)與b1)或b2)限定的核苷酸序列具有85％或85％以上同一性，且編碼鮭魚降鈣素的前體的DNA分子；

b4)在嚴(yán)格條件下與b1)或b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述鮭魚降鈣素的前體的DNA分子。

所述鮭魚降鈣素的前體可為氨基酸序列如序列表中序列5自N末端起第158至190位所示的蛋白質(zhì)。

含有所述DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述重組載體可為將所述DNA分子插入出發(fā)質(zhì)粒，得到的重組質(zhì)粒。

所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒pBO-sCT2301。所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301為將載體pCAMBIA2301的限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRI識別序列間的小片段替換為序列表中序列4所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301表達(dá)序列表中序列5所示的蛋白質(zhì)。

所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒pBO-sCT2301-DZ。所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301和所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301-DZ的唯一不同在于：所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301中鮭魚降鈣素的前體的編碼基因(即sCT基因)為序列表中序列4自5′末端起第1363至1461位所示，所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301-DZ中鮭魚降鈣素的前體的編碼基因(即sCT-DZ基因)為序列表中序列7自5′末端起第22至120位所示。所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301-DZ表達(dá)序列表中序列5所示的蛋白質(zhì)。

所述重組微生物可為將所述重組載體導(dǎo)入出發(fā)微生物得到的重組菌。所述出發(fā)微生物可為根癌農(nóng)桿菌。所述根癌農(nóng)桿菌具體可為根癌農(nóng)桿菌LBA4404。