[發明專利]一種能夠穩定遺傳的白化大鱗副泥鰍育種方法

有效

• 申請號: 201710014992.7
• 申請日: 2017-01-09
• 公開（公告）號: CN106636204B
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發明（設計）人: 曹小娟;徐秀文;高堅
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

本發明公開了一種能夠穩定遺傳的白化大鱗副泥鰍育種方法，它是在大鱗副泥鰍TYR基因序列上設計TYR基因靶位點，然后設計上游引物及與其匹配的下游引物，以骨架質粒為模版進行PCR擴增，體外轉錄、純化后得到gRNA；以線性化Cas9質粒為模版，體外轉錄、純化后得到Cas9mRNA；對大鱗副泥鰍受精卵顯微注射，之后將受精卵進行孵化培育，并對基因敲除魚進行雜交，獲得能夠穩定遺傳的白化大鱗副泥鰍。

技術領域

本發明屬于分子育種領域，尤其涉及一種利用CRISPR/Cas9系統敲除大鱗副泥鰍色素基因從而生產白化大鱗副泥鰍的方法。

背景技術

隨著觀賞水族行業在國內的穩步發展，觀賞類生物的品種的逐年激增，以鰍科魚類為代表的原生魚種也逐漸為廣大水族愛好者所熟知。其中，白化鰍科魚種從外觀上可以看到其皮膚白色或淺紅色，眼睛紅色并且透明。因為這種性狀的奇異性和稀少性，所以尤其受到廣大水族消費者的追捧。目前，這些新的觀賞魚類資源主要由野外捕撈篩選，隨機性大，產量極少，難已滿足廣大水族愛好者的獵奇需求。并且由于白化魚種的白化魚苗發育胚胎的透明性，它們經常被用來做單性發育的研究材料，為研究遺傳基因在正常魚體所發揮的作用提供可見的有力的證據。因此，運用現代生物技術定向改造魚類體色，穩定批量生產符合市場及科研需求的白化鰍科魚類將具有很大的發展空間。

CRISPR/Cas9基因敲除系統是近兩年發展起來的一種來源于細菌獲得性免疫系統的基因編輯技術，經過人工的改造，目前已被廣泛運用于多種模式生物的研究，成為一種強大的研究工具。酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)是催化黑色素形成的關鍵酶，主要存在于黑色素細胞中。黑色素細胞廣泛存在于魚類等脊椎動物的表皮中。TYR基因主要在皮膚、腦和眼中都有表達，其中眼部和黑色皮膚表達最高。從青鳉魚中分離出多個白化突變體，對它們TYR突變基因的分析表明，缺失突變和轉座子插入是導致白化的兩種主要突變類型。將正常的TYR基因轉移到白化魚體內，轉基因魚的體色得到了不同程度的恢復。是一種常染色體隱性遺傳病。

因此，在分子育種領域中，利用CRISPR/Cas9系統敲除鰍科魚類TYR基因生產白化鰍科魚種的技術，將是一種具有重大意義的發明，且目前還沒有出現相關研究的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用CRISPR/Cas9系統敲除鰍科魚類大鱗副泥鰍的TYR基因，從而生產白化大鱗副泥鰍的分子育種技術。用于定向改造魚類體色，不僅可以有效解決觀賞魚市場白化魚種供需困難的問題，還可以提供科學研究所需要的白化魚類胚胎。

本發明通過以下內容實現：

1、大鱗副泥鰍TYR基因序列信息的確定：

①首先，使用RNAiso Plus試劑(TaKaRa，日本)提取大鱗副泥鰍皮膚總RNA，再使用逆轉錄試劑盒1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，日本)體外合成第一鏈cDNA。

②由NCBI數據庫中獲取斑馬魚，草魚，團頭魴等魚類TYR基因全長cDNA序列，后進行多重比對，讀取這些魚類保守區域氨基酸序列的保守區域設計合成1對簡并引物，用于克隆大鱗副泥鰍TYR基因核心片段，回收產物送公司測序，得到其序列信息。

③使用SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech,USA)試劑盒，參照試劑盒推薦方法合成5’、3’-RACE cDNA第一鏈。再在②步驟中得到的核心片段序列上的設計RACE引物，分別以5’、3’-RACE cDNA第一鏈為模板，克隆大鱗副泥鰍TYR基因5’和3’末端片段，回收產物送公司測序，得到其序列信息。

④拼接得到大鱗副泥鰍TYR基因全長序列信息。大鱗副泥鰍TYR基因全長序列信息如SEQ ID NO：1所示。

2、CRISPR/Cas9靶位點設計及確認：