[發明專利]一種選育半顯性矮稈水稻光溫敏核不育系的方法

在審

• 申請號: 201710014930.6
• 申請日: 2017-01-09
• 公開（公告）號: CN106818456A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 吳爽
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院水稻研究所
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;A01H1/04
• 代理公司: 上海華誠知識產權代理有限公司31300
• 代理人: 董澤宇

1.一種選育半顯性矮稈水稻光溫敏核不育系的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1） 將含有第8染色體上新發現的控制株高的QTL的水稻，通過人工雜交，使控制株高的QTL轉入到目前生產上大面積使用的光溫敏核不育系中；

（2）在步驟（1）培育的后代中，運用連鎖的分子標記早期選擇含有半顯性QTL單株；

（3）運用光溫智慧控制系統結合花粉鏡檢和不育性觀察，篩選不育起點溫度在23.5℃左右的半矮稈單株；

（4）選取步驟（3）中的半矮稈單株多代自交，使性狀趨于穩定。

2.如權利要求1所述的一種選育半顯性矮稈水稻光溫敏核不育系的方法，其特征在于，步驟（1）中將含有第8染色體上新發現的控制株高的QTL的水稻為皖矮907S，可育期取P88S、C815S單株，人工去除花藥，授以皖矮907S花粉，人工配制雜交種子，以P88S、C815S作為輪回親本，多代回交，得到回交后代單株。

3.如權利要求1或2所述的一種選育半顯性矮稈水稻光溫敏核不育系的方法，其特征在于，所述的步驟（2）具體包括：

1）參照Rogers和Bendich公開的CTAB法提取DNA；

取0.5g的葉片在液氮中快速研磨成粉末，轉移至1.5ml eppendorf 管中，至1/3體積處；加入600μl 65℃的2×CTAB提取緩沖液，然后65℃溫浴15-20min，其間搖勻1-2次；取出eppendorf管，加入600μl氯仿：異戊醇=24:1混合液，混合均勻后，65℃溫浴5-10min，其間充分搖勻一次；10,000rpm離心10min，取出后吸取上清液到新的eppendorf 管中；加入500μl預冷的異丙醇混合均勻，放入4℃冰箱12小時以上使DNA沉淀；12,000rpm離心2min，使DNA沉于管底，去上清液；加入500μl 70% 乙醇洗滌沉淀；倒掉70%乙醇，再用無水乙醇洗滌一次，風干15-30min后，加入200μl 0.1×TE 緩沖液溶解DNA，然后置于4℃冰箱中保存備用；

2）SSR引物擴增；

擴增反應體系為20μl：2μl含有MgCl₂ 的10×Buffer、0.25μl dNTP （10m mol）、2μl 濃度40ng/μl的Primer、0.3μl 的2.5U/μl的Taq、2μl濃度為0.5μg/μl模板DNA、13.45μl的 ddH₂O；

反應過程：首先在95℃條件下，變性5min；然后進入擴增循環： 95℃條件變性30sec、55℃條件下退火30sec、72℃條件下延伸60sec，循環35次；最后72℃條件下延伸10min；在4℃下保存；

3）聚丙烯酰胺凝膠電泳及顯影

擴增反應產物用8%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，然后用銀染法顯影：依次用10%醋酸固定30min、去離子水連續漂洗3次、在每升含有1g AgNO3和1.5ml 37%的甲醛染色液中染色30min、去離子水迅速漂洗5-10s、把玻璃板放入預冷的顯影液中，其中1L顯影液中含無水碳酸鈉30g，37%的甲醛1.5ml，200μl 10%的硫代硫酸鈉，顯影液-20℃預冷，顛倒顯影液直至擴增條帶清楚顯現，再用10%醋酸固定5-6min，最后用去離子水漂洗2-3min；

4）基因型的獲得及單株選擇

利用與半顯性矮稈QTL緊密連鎖的SSR引物獲得每個單株的基因型，與皖矮907S基因型相同，則含有純合半顯性QTL,保留該單株；與P88S或C815S基因型相同，則去掉該單株；如為雜合類型，可保留繼續種植在后代中再進行分子檢測和篩選。

4.如權利要求1或2所述的一種選育半顯性矮稈水稻光溫敏核不育系的方法，其特征在于，所述步驟（3）包含以下步驟：

根據生育進程，將水稻始穗期安排在7、8月份，將收獲的不育系種子濕潤育秧后，秧齡達25d時，選長勢均勻一致的秧苗移栽到直徑為30cm并裝有深20cm泥土的塑料桶中，每個桶均勻栽插7株，活棵后正常施肥、治蟲維護秧苗正常生長；

在育性轉換敏感期，即花粉母細胞形成期至減數分裂期時移入水溫保持在23.5℃的冷水池中進行低溫處理7天左右，之后移出冷水池放到適宜環境中，只留下處于葉枕平時期的分蘗，即花粉母細胞減數分裂期的分蘗，抽穗后進行花粉鏡檢，為正常可育花粉的則剔除；花粉育性沒有改變，割茬再生，在自然短日低溫下生產不育系種子，也可利用光溫智慧控制系統創造短日低溫環境。

5.如權利要求4所述的一種選育半顯性矮稈水稻光溫敏核不育系的方法，其特征在于，所述的光溫智慧控制系統包括控制箱、連接控制箱的水溫傳感器和光照傳感器、連接控制箱并接受控制箱控制的電磁閥和智能遮光簾，所述控制箱連接網關，通過網關連接局域網和Internet網并將水溫傳感器和光照傳感器檢測數據上傳，局域網和Internet網連接終端設備。