[發(fā)明專利]一種蛋白體外SUMO化修飾快速檢測(cè)試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710014909.6
• 申請(qǐng)日: 2017-01-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108285918A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-07-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡啟良;干勁;朱彩霞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/37
• 分類號(hào): C12Q1/37;C12N9/50;C12N15/57
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

本發(fā)明屬生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及蛋白體外SUMO化修飾快速檢測(cè)試劑盒，尤其涉及克隆和原核表達(dá)SUMO化修飾系統(tǒng)的E1，E2，E3以及SUMO?1和SUMO?2分子，以及應(yīng)用于人源蛋白體外SUMO化修飾驗(yàn)證。本發(fā)明中使用大腸桿菌原核表達(dá)并純化SUMO化E1酶AOS?Uba1，E2酶Ubc9，E3酶KAP1以及SUMO?1和SUMO?2分子，在合適的反應(yīng)緩沖液、時(shí)間、溫度和蛋白濃度配比下，對(duì)特定的SUMO E3連接酶或是蛋白底物進(jìn)行體外SUMO化修飾。該試劑盒可以方便、準(zhǔn)確地鑒定底物蛋白是否具有SUMO化修飾，能被廣范圍應(yīng)用于SUMO化修飾驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及蛋白體外SUMO化修飾快速檢測(cè)試劑盒，尤其涉及克隆和原核表達(dá)SUMO化修飾系統(tǒng)的E1，E2，E3以及SUMO-1和SUMO-2分子，以及應(yīng)用于人源蛋白體外SUMO化修飾驗(yàn)證。

背景技術(shù)

現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin-like modifier,SUMO)具有與泛素分子相近的分子量和相似修飾循環(huán)，被稱為小分子泛素樣修飾蛋白。研究顯示，在哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中共有四類SUMO同種型(isoform),分別為SUMO-1,-2,-3和-4，其中，SUMO-1只能形成單SUMO修飾；SUMO-2和SUMO-3高度同源，序列一致性高達(dá)97％，可以形成多聚SUMO修飾，而SUMO-4具有組織特異性，且功能尚不清楚。有研究顯示，SUMO分子經(jīng)SENP酶切割活化后，依次經(jīng)過(guò)E1激活酶，E2結(jié)合酶和E3連接酶作用，其C末端甘氨酸可與底物蛋白上的賴氨酸共價(jià)鏈接，從而實(shí)現(xiàn)SUMO化修飾，其中SUMO化E1激活酶由兩個(gè)蛋白組成復(fù)合物共同協(xié)作；SUMO修飾主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，可影響酶活性，改變蛋白亞細(xì)胞定位，或是作為促進(jìn)蛋白相互作用的信號(hào)，參與大型蛋白復(fù)合物的組裝，最終廣泛參與了基因轉(zhuǎn)錄的抑制與激活，DNA復(fù)制與修復(fù)，染色體重組與分離等過(guò)程；因此研究蛋白質(zhì)的SUMO化具有重要的意義，而鑒定蛋白SUMO化修飾是SUMO相關(guān)研究中最重要的內(nèi)容之一。

基于現(xiàn)有技術(shù)研究的現(xiàn)狀，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供一種蛋白體外SUMO化修飾快速檢測(cè)試劑盒，進(jìn)一步應(yīng)用于人源蛋白體外SUMO化修飾驗(yàn)證。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于基于現(xiàn)有技術(shù)研究的現(xiàn)狀，提供蛋白體外SUMO化修飾快速檢測(cè)試劑盒，尤其涉及克隆和原核表達(dá)SUMO化修飾系統(tǒng)的E1，E2，E3以及SUMO-1和SUMO-2分子，進(jìn)一步應(yīng)用于人源蛋白體外SUMO化修飾驗(yàn)證。

更具體的，本發(fā)明提供了蛋白體外SUMO化修飾快速檢測(cè)試劑盒，其包括，克隆和原核表達(dá)SUMO化修飾系統(tǒng)的E1，E2，E3以及SUMO-1和SUMO-2分子。

本發(fā)明中的試劑盒應(yīng)用于人源蛋白體外SUMO化修飾驗(yàn)證，其包括；

克隆人源SUMO化E1激活酶AOS1和Uba2基因,其中AOS1全長(zhǎng)cDNA序列克隆至pET-28a原核表達(dá)載體，在其N端有用于純化和檢測(cè)His蛋白標(biāo)簽核酸序列；Uba2全長(zhǎng)cDNA序列克隆至pET-11d；

本發(fā)明所述的編碼蛋白為人源SUMO化E1蛋白酶AOS1和Uba2的氨基酸序列，所述序列AOS1蛋白的cDNA片段長(zhǎng)為1038bp,編碼346個(gè)氨基酸，分子量為38450Da的蛋白，序列如SEQID No:1所示的氨基酸序列；所述序列Uba2蛋白的cDNA片段長(zhǎng)為1920bp,編碼640個(gè)氨基酸，分子量為71224Da的蛋白，序列如SEQID No:2所示的氨基酸序列；所述的氨基酸序列，還包括SEQID No:1和SEQID No:2的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相應(yīng)編碼所需的核苷酸序列；

本發(fā)明提供了一種核苷酸序列，該核酸序列編碼上述的蛋白質(zhì)；

本發(fā)明中，分別利用所述的AOS1和Uba2重組原核表達(dá)載體，在E.coli BL21(DE3)中成功表達(dá)出重組蛋白，兩個(gè)蛋白在緩沖液中互作結(jié)合之后，利用His標(biāo)簽純化AOS1-Uba2蛋白；