[發(fā)明專利]唐古特白刺液泡膜H+

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710014268.4
• 申請日: 2017-01-09
• 公開（公告）號: CN106929492B
• 公開（公告）日: 2020-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊秀艷;李煥勇;唐欣;劉正祥;張華新;朱建峰;成鐵龍;常二梅;段曉波;王文軍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國林業(yè)科學(xué)研究院;北京騏驥生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12N15/55;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 北京同達(dá)信恒知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11291
• 代理人: 黃志華

1.一種唐古特白刺液泡膜H⁺-PPase蛋白基因NtVP1，所述基因的全長cDNA序列如SEQ IDNO:6所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的唐古特白刺液泡膜H⁺-PPase蛋白基因NtVP1，其中，所述基因的編碼區(qū)序列如SEQ ID NO:6的第106-2409位所示。

3.一種唐古特白刺液泡膜H⁺-PPase蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

4.一種克隆唐古特白刺液泡膜H⁺-PPase蛋白基因NtVP1的方法，包括步驟：

1)根據(jù)與唐古特白刺有近緣關(guān)系的植物的液泡膜H⁺-PPase蛋白基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物對；

2)以唐古特白刺葉片的總RNA為模板，利用步驟1)的簡并引物對通過RT-PCR的方法得到cDNA片段；

3)根據(jù)步驟2)所獲得的cDNA片段，設(shè)計(jì)3’RACE和5’RACE引物，通過巢式擴(kuò)增得到全長cDNA序列。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述簡并引物對為NtVP1-F1和NtVP1-R1：

NtVP1-F1：CATTCGCCATTCAGG(SEQ ID NO:1)，

NtVP1-R1：ACATAGCAGCCAAAGT(SEQ ID NO:2)；

其中，步驟2)獲得序列如SEQ ID NO:3所示的cDNA片段，其長度為1156bp；

其中，步驟3)中，所述引物序列如下：

UPM：

CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO:10)；

3’RACE：TGCCAATCCAGTGGCAATAGTGCTGA(SEQ ID NO:4)；

5’RACE：ACAACTGCTGCCATCGGAAAGGGATT(SEQ ID NO:5)；

其中，獲得的全長cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

6.一種表達(dá)載體或表達(dá)菌株，所述表達(dá)載體或表達(dá)菌株包含如權(quán)利要求1或2所述的唐古特白刺液泡膜H⁺-PPase蛋白基因NtVP1。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體或表達(dá)菌株，其中，所述表達(dá)載體是帶有GFP的載體，所述表達(dá)菌株是農(nóng)桿菌。

8.一種表達(dá)載體的構(gòu)建方法，所述表達(dá)載體包含如權(quán)利要求1或2所述的唐古特白刺液泡膜H⁺-PPase蛋白基因NtVP1，包括：1)在NtVP1基因的cDNA序列或其編碼區(qū)序列的兩端分別加上Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)，并連接到T載體，形成T-NtVP1載體；2)將T-NtVP1載體，以及pCG-GFP和pSN1301分別用Xba I和Kpn I進(jìn)行酶切，并回收；3)將從T-NtVP1載體上酶切下來的基因片段與pCG-GFP和pSN1301載體的酶切片段連接。

9.一種將唐古特白刺液泡膜H⁺-PPase蛋白基因NtVP1轉(zhuǎn)染至植物的方法，包括將權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體或表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化至擬南芥中。

10.如權(quán)利要求1或2所述的唐古特白刺液泡膜H⁺-PPase蛋白基因NtVP1在制備或培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。