[發明專利]高純度雞前體肌內脂肪細胞的分離純化及構建其與肌衛星細胞共培養體系的方法

有效

• 申請號: 201710014149.9
• 申請日: 2017-01-09
• 公開（公告）號: CN106591224B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 崔煥先;文杰;趙桂蘋;劉冉冉;鄭麥青;李慶賀
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 范盈

本發明涉及一種高純度雞前體肌內脂肪細胞的分離純化及構建其與肌衛星細胞共培養體系的方法，包括將雞胸肌組織剪成肉糜，用I型膠原酶消化后離心；吸取上層成熟肌內脂肪細胞，接種于培養瓶，去分化處理，最終獲得雞前體肌內脂肪細胞；將離心后下層細胞沉淀重懸，差速貼壁純化細胞，得到高純度的肌衛星細胞，將前體肌內脂肪細胞和肌衛星細胞分別接種于transwell小室或配套的培養板，構建共培養體系。該發明方法突破了一直以來無法單獨分離純化雞前體肌內脂肪細胞的技術瓶頸，可應用于量化模擬雞肌肉組織，體外精準研究雞肌內脂肪細胞與肌細胞之間的相互影響關系及分子調控機理，以及相關營養素或藥物的篩選研發。

技術領域

本發明涉及細胞學領域，具體涉及雞前體肌內脂肪細胞的分離純化，并構建雞前體肌內脂肪細胞和肌衛星細胞共培養體系的方法。

背景技術

動物脂肪主要分布在內臟周圍、皮下和肌肉等組織部位。其中，肌內脂肪(Intramuscular fat,IMF)是指沉積于肌內膜或肌束膜內外的脂質，可以影響肌肉品質(嫩度、口感、風味)。在一定范圍內，肌內脂肪的含量越高，肉的品質就越好；然而，雞腹部脂肪蓄積過多會降低飼料的利用效率，也會額外增加加工費用，并造成一定的環境污染。因此，肌內脂肪和腹脂沉積涉及肉品質與生產效率兩個指標，其均衡調控是肉雞生產中重要科學命題。高肌內脂肪、低腹脂的體脂分布是優質肉雞胴體性狀改良的理想目標之一。

與豬、牛、羊等家畜不同，雞肌內脂肪組織分布不均勻，一般不可見，無法直接采集純的脂肪組織；另外，由于從肌肉組織分離前體肌內脂肪細胞和肌衛星細胞的密度差異不大，只能獲得細胞的混合物。所以一直以來無法有效分離高純度的前體肌內脂肪細胞。這一技術難題極大地限制了體外開展針對雞肌內脂肪細胞、雞肌內脂肪細胞與肌細胞之間的相互影響關系及分子調控機理，以及相關營養素或藥物的篩選研發等方面的研究工作。

過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activatedreceptor，PPARγ)、脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase，LPL)、脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白(Fatty acid binding protein 4，FABP4)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，FASN)、乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)、肉堿軟脂酰轉移酶-1b(Carnitinepalmitoyl transferase-1b，CPT-1b)是脂肪細胞的標志性基因。其中，LPL是脂肪細胞早期分化的標志性基因；PPARγ是脂肪開始生成轉錄的標志性蛋白；FABP4作為脂肪酸結合蛋白家族中的一員，在脂肪細胞分化過程中起著轉運脂肪酸的關鍵作用；FASN和ACC是脂肪細胞分化過程中調控脂肪酸合成的關鍵酶；而CPT-1b則在脂肪酸氧化供能過程中的關鍵調控作用。

本發明提供了一種可以分離獲得高純度的雞肌內前體脂肪細胞，并高效、量化模擬體內肌肉組織細胞發育環境的雞肌內前體脂肪細胞和肌衛星細胞的共培養體系；并針對上述相關的標志性基因鑒定雞前體脂肪細胞，雞前體脂肪細胞的增殖、分化和傳代能力，以及構建的共培養體系的有效性。

發明內容

本發明的目的是提供一種高純度雞前體肌內脂肪細胞的分離純化及構建其與肌衛星細胞共培養體系的方法，該發明方法突破了一直以來無法單獨分離純化雞前體肌內脂肪細胞的技術瓶頸，可應用于量化模擬雞肌肉組織，體外精準研究雞肌內脂肪細胞與肌細胞之間的相互影響關系及分子調控機理，以及相關營養素或藥物的篩選研發。

本發明所述方法包括將雞胸肌組織剪成肉糜，用I型膠原酶消化后離心；吸取上層成熟肌內脂肪細胞，接種于培養瓶，去分化處理，最終獲得雞前體肌內脂肪細胞；將離心后下層細胞沉淀重懸，差速貼壁純化細胞，得到高純度的肌衛星細胞，將前體肌內脂肪細胞和肌衛星細胞分別接種于transwell小室或配套的培養板，構建共培養體系。

具體地，本發明上述方法包括以下步驟：