[發明專利]一種用于檢測哺乳動物萊姆病的熒光素酶免疫共沉淀試劑盒

有效

• 申請號: 201710011209.1
• 申請日: 2017-01-06
• 公開（公告）號: CN106771250B
• 公開（公告）日: 2018-08-21
• 發明（設計）人: 吳琦;唐東起;張云云;鄭虹
• 申請（專利權）人: 杭州京北生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏;趙越劍

1.一種用于檢測哺乳動物萊姆病的熒光素酶免疫試劑盒，其特征在于，包含以下組分：(1)樣本稀釋液；(2)海腎熒光素酶和伯氏疏螺旋體表膜蛋白OspC抗原組成的融合蛋白液；(3)proteinA/G包被的酶標板；(4)洗滌液；(5)熒光素酶底物；

所述海腎熒光素酶和伯氏疏螺旋體表膜蛋白OspC抗原組成的融合蛋白的氨基酸序列選自以下之一：

(1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；

(2)與SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列相差總共不超過三個氨基酸添加、替換和/或缺失的氨基酸序列。

2.根據權利要求1所述的熒光素酶免疫試劑盒，其特征在于，所述樣本稀釋液組成如下：20mM Tris pH7.5，150mM NaCl，5mM MgCl₂，1％Triton X-100，水余量。

3.根據權利要求1所述的熒光素酶免疫試劑盒，其特征在于，所述融合蛋白液通過以下方法制備而成：

a、以OspC抗原基因序列為模板進行PCR擴增，PCR擴增產物經凝膠電泳及核酸純化獲得OspC抗原基因片段；

b、將獲得的OspC抗原基因片段與帶海腎熒光素酶基因的pREN2載體質粒分別進行BamH1和Xbal 1雙酶切，并使用T4連接酶將酶切產物連接得到重組質粒；

c、將重組質粒轉化到大腸桿菌DH5α中，通過菌液PCR篩選轉基因陽性菌；

d、在200ml LB液體培養基中擴繁轉基因陽性菌，并用質粒提取試劑盒提取重組質粒；

e、通過瓊脂糖凝膠電泳驗證步驟d提取重組質粒的質量，通過紫外分光光度計檢測提取重組質粒的純度和濃度；

f、在10cm2細胞培養皿中培養293T細胞，當細胞鋪板率達到80-90％時，以脂質體核酸轉染試劑：步驟d所得重組質粒按照3μL∶1μg的比例進行轉染，37℃、5％CO2培養箱中培養48-72h，棄細胞培養液，并加入5ml 0.01M、pH7.4的磷酸緩沖液用細胞刮刀將細胞收集至15ml離心管中，最后將細胞收集液在冰浴中超聲處理15～30min得細胞裂解液，然后將細胞裂解液于4℃，12000rpm離心15～45min，棄沉淀，收集上清液即為融合蛋白；

g、將上述所得融合蛋白用0.01M、pH7.4的PBS磷酸鹽緩沖液稀釋得融合蛋白液，要求融合蛋白液每10μL中有107個熒光單位，-20℃保存備用。

4.根據權利要求3所述的熒光素酶免疫試劑盒，其特征在于，步驟a中，PCR擴增的引物為：

上游引物：5′-GAGGGATCCATGAAAAAGAATACA-3′，

下游引物：5′-GAGCTCGAGTTAAGGGTTTTTTGGACTTTCT-3′。

5.根據權利要求1或2所述的熒光素酶免疫試劑盒，其特征在于，所述proteinA/G包被的酶標板的制備方法：

a、proteinA/G用0.01M、pH7.4PBS溶解為1μg/mL的濃度，

b、按照100μL/孔將上述proteinA/G溶液加入酶標板中，酶標板覆膜，4℃孵育12～16h，

c、棄proteinA/G溶液，300μL/孔用0.1％PBST洗3次，4℃保存。

6.根據權利要求1或2所述的熒光素酶免疫試劑盒，其特征在于，所述洗滌液配制方法為：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.63g，KH₂PO₄ 0.24g，加水定容至1L，滅菌。