[發(fā)明專利]安卡拉病毒亞單位疫苗的制備方法及應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710010892.7 | 申請日： | 2017-01-06 |
| 公開（公告）號： | CN106755106A | 公開（公告）日： | 2017-05-31 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 金梅林;張丹;鄧雪霞;馬季;康超;楊影;魏燕鳴;張強(qiáng);孫小美 | 申請（專利權(quán)）人： | 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/866 | 分類號： | C12N15/866;C12N15/66;C12P21/02;A61K39/235;A61P31/20 |
| 代理公司： | 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司42104 | 代理人： | 樊戎,馮超 |
| 地址： | 430070 湖*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 安卡拉 病毒 單位 疫苗 制備 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton，其特征在于：所述重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton是在載體pFastBac HTB的BamHI和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)間插入Penton基因構(gòu)建而成，其中，Penton基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一種權(quán)利要求1所述重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton的構(gòu)建方法，其特征在于：包括以下步驟：
1)Penton基因的獲得
設(shè)計(jì)引物：
以安卡拉病毒的全基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增回收得到含有酶切位點(diǎn)BamHI/HindⅢ的Penton基因；
2)重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton的構(gòu)建
以載體pFastBac HTB為骨架，用限制性內(nèi)切酶酶切載體pFastBac HTB和含有酶切位點(diǎn)BamHI/HindⅢ的Penton基因，得到線性化的pFastBac HTB和線性化的Penton基因，用連接酶將線性化的pFastBac HTB和線性化的Penton基因連接，得到重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton。
3.一種權(quán)利要求2所述重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟1)中，
PCR體系：
PCR條件：94℃預(yù)變性5min，PCR循環(huán)為95℃30s，50℃退火30s，68℃1min；30個(gè)循環(huán)后，68℃延伸10min；
所述步驟2)中，酶切體系：
酶切條件：將上述體系混勻后37℃酶切反應(yīng)3h。
4.一種重組桿狀病毒Ac-Penton，其特征在于：所述重組桿狀病毒Ac-Penton的基因組中含有權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton。
5.一種權(quán)利要求4所述重組桿狀病毒Ac-Penton的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：
1)1)Penton基因的獲得
設(shè)計(jì)引物：
以卡拉病毒的全基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增回收得到含有酶切位點(diǎn)BamHI/HindⅢ的Penton基因；
2)重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton的構(gòu)建
以載體pFastBac HTB為骨架，用限制性內(nèi)切酶酶切載體pFastBac HTB和含有酶切位點(diǎn)BamHI/HindⅢ的Penton基因，得到線性化的pFastBac HTB和線性化的Penton基因，用連接酶將線性化的pFastBac HTB和線性化的Penton基因連接，得到重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton。
3)重組桿粒Bacmid-Penton
將重組質(zhì)粒pFastBac HTB-Penton轉(zhuǎn)化DH10Bac E.coli感受態(tài)細(xì)胞，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后取少量培養(yǎng)液劃線于含有卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素和IPTG、X-gal的高鹽LB平板培養(yǎng)，通過藍(lán)白斑篩選挑取單個(gè)白色菌落PCR鑒定正確后接種含有抗生素的的LB液體培養(yǎng)基中，37℃220rpm/min振動培養(yǎng)振搖培養(yǎng)過夜，提取得到重組桿粒Bacmid-Penton；
4)重組桿狀病毒Ac-Penton獲得
將重組桿粒Bacmid-Penton轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，4-7天后觀察到細(xì)胞有明顯病變，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心去除細(xì)胞碎片，收集上清即獲得重組桿狀病毒Ac-Penton。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述重組桿狀病毒Ac-Penton的制備方法，其特征在于：所述步驟1)中，
PCR體系：
PCR條件：94℃預(yù)變性5min，PCR循環(huán)為95℃30s，50℃退火30s，68℃1min；30個(gè)循環(huán)后，68℃延伸10min；
所述步驟2)中，酶切體系：
酶切條件：將上述體系混勻后37℃酶切反應(yīng)3h。
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