[發明專利]一種瘧原蟲pf/pan檢測試紙的制備方法

在審

• 申請號: 201710009907.8
• 申請日: 2017-01-06
• 公開（公告）號: CN106908602A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 馬軍;丁錦勤;黃政
• 申請（專利權）人: 蘇州萬木春生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 蘇州廣正知識產權代理有限公司32234
• 代理人: 馬云玉

1.一種瘧原蟲pf/pan檢測試紙的制備方法，其特征在于，包括步驟為：

（1）制備pf重懸液：所述pf重懸液中包括三羥甲基氨基甲烷、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和吐溫20，將三羥甲基氨基甲烷、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和吐溫20溶于水并定容，調節pH值至8-9得到；制備pan重懸液：所述pan重懸液中包括三羥甲基氨基甲烷、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和酪蛋白，將三羥甲基氨基甲烷、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和酪蛋白溶于水并定容，調節pH值至8-9得到；制備包被基液：海藻糖溶于pH值為7-8的磷酸緩沖溶液并定容得到；

（2）將膠體金與碳酸鉀混合并調節pH值，再加入惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶pfLDH單克隆抗體、牛血清白蛋白溶液混合，離心得到第一沉淀，所述第一沉淀用所述pf重懸液重懸，得到pf免疫金；將膠體金與碳酸鉀混合并調節pH值，再加入瘧原蟲乳酸脫氫酶panLDH單克隆抗體、牛血清白蛋白溶液混合，離心得到第二沉淀，所述第二沉淀用所述pan重懸液重懸，得到pan免疫金；

（3）用所述包被基液稀釋所述惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶pfLDH單克隆抗體得到惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶pfLDH單克隆抗體檢測線包被液；用所述包被基液稀釋所述瘧原蟲乳酸脫氫酶panLDH單克隆抗體得到瘧原蟲乳酸脫氫酶panLDH單克隆抗體檢測線包被液；用所述包被基液稀釋羊抗鼠IgG多抗得到對照線包被液；

（4）用所述pf免疫金對金墊噴金得到pf免疫金墊；用所述pan免疫金對金墊噴金得到pan免疫金墊；用所述惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶pfLDH單克隆抗體檢測線包被液、所述瘧原蟲乳酸脫氫酶panLDH單克隆抗體檢測線包被液和所述對照線包被液分別在貼于聚氯乙烯底板的硝酸纖維素膜上劃線，得到點膜的聚氯乙烯底板；

（5）將樣品墊、所述pf免疫金墊、所述pan免疫金墊、所述點膜的聚氯乙烯底板和吸水紙組裝在一起，切割成瘧原蟲pf/pan檢測試紙。

2.根據權利要求1所述的瘧原蟲pf/pan檢測試紙的制備方法，其特征在于，步驟（1）中所述pf重懸液中所述三羥甲基氨基甲烷、所述蔗糖、所述海藻糖、所述牛血清白蛋白、所述吐溫20和定容總體積的比例為0.242g：10g：5g：1g：0.2 mL：100mL；所述pan重懸液中所述三羥甲基氨基甲烷、所述蔗糖、所述海藻糖、所述牛血清白蛋白、所述酪蛋白和定容總體積的比例為0.242g：10g：5g：1g：0.2g：100mL。

3.根據權利要求1所述的瘧原蟲pf/pan檢測試紙的制備方法，其特征在于，步驟（1）中所述pf重懸液的pH值用1M鹽酸調節至8.5；所述pan重懸液的pH值用1M鹽酸調節至9.0；所述磷酸緩沖溶液為0.01M、pH值為7.4的磷酸緩沖溶液。

4.根據權利要求1所述的瘧原蟲pf/pan檢測試紙的制備方法，其特征在于，步驟（2）中制備pf免疫金的具體步驟為：將膠體金與碳酸鉀混合并調節pH值后攪拌5min，加入惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶pfLDH單克隆抗體并攪拌5min，再加入牛血清白蛋白溶液混合并攪拌5min，在4℃、轉速為6000r/min的條件下離心 30min得到第一沉淀，所述第一沉淀用所述pf重懸液重懸至離心前體積的1/10，得到pf免疫金；制備pan免疫金的具體步驟為：將膠體金與碳酸鉀混合并調節pH值后攪拌5min，加入瘧原蟲乳酸脫氫酶panLDH單克隆抗體并攪拌5min，再加入牛血清白蛋白溶液混合并攪拌5min，在4℃、轉速為6000r/min的條件下離心 30min得到第二沉淀，所述第二沉淀用所述pan重懸液重懸至離心前體積的1/20，得到pan免疫金。

5.根據權利要求1或4所述的瘧原蟲pf/pan檢測試紙的制備方法，其特征在于，步驟（2）中所述碳酸鉀為0.2M碳酸鉀，所述0.2M碳酸鉀和所述惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶（pfLDH）單克隆抗體的比例為3uL/mL:10μg/mL，所述0.2M碳酸鉀和所述瘧原蟲乳酸脫氫酶panLDH單克隆抗體的比例為4uL/mL:5μg/mL；所述牛血清白蛋白溶液為質量分數為10%的牛血清白蛋白溶液，所述質量分數為10%的牛血清白蛋白溶液的加入體積為所述膠體金體積的1/10；攪拌是置于磁力攪拌器上實現的。