[發明專利]一種利用RNA干擾防治紅火蟻的方法及降低紅火蟻抗藥性的應用

在審

• 申請號: 201710009599.9
• 申請日: 2017-01-06
• 公開（公告）號: CN106818851A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 張百重;謝蘭芬;李廣領;王建華;孔凡彬
• 申請（專利權）人: 河南科技學院
• 主分類號: A01N57/16
• 分類號: A01N57/16;A01P7/04;C12N15/10;A01K67/033
• 代理公司: 北京漢昊知識產權代理事務所(普通合伙)11370
• 代理人: 馮譜

技術領域

本發明涉及紅火蟻的防治技術，具體涉及一種利用RNA干擾防治紅火蟻的方法及降低紅火蟻抗藥性的應用。

背景技術

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近年來發現的一種新的基因調控方法(Matzke,2001)。即利用外源或內源的雙鏈RNA(dsRNA)特異性地引起基因表達沉默的現象。它利用RNA序列匹配，專一地識別靶基因，在轉錄水平、轉錄后水平或翻譯水平抑制靶基因表達，已被廣泛用于基因功能研究、疾病治療和農業應(Waterhouse,2003；Matthew,2004)，目前，RNAi技術已被應用于鱗翅目、直翅目、膜翅目(意大利蜜蜂)、同翅目、雙翅目瞪昆蟲。昆蟲RNAi的方法主要有注射、浸泡、喂食、轉基因和病毒介導等方法。比較常用的是注射和飼喂兩種方法。注射dsRNA到昆蟲中以抑制基因表達，這種方法的主要優點是效率高，但也有一些缺點。通過喂食dsRNA操作簡單方便，容易實現。通過飼喂dsRNA已在半翅目、鞘翅目和鱗翅目昆蟲取得成功(Baum et al.,2007；Mao et al.,2007)。

紅火蟻(S.invicta)是最具有入侵性的社會性昆蟲，已經被國際上列為最具入侵性和破壞性的百種外來有害生物之一。紅火蟻食性復雜、習性兇猛、繁殖迅速、競爭力強，能造成重大經濟損失、社會危害和環境影響，紅火蟻的雜食性和攻擊性使其不僅是一種經濟害蟲，還威脅到公眾健康。化學防治措施仍然是防治紅火蟻有效措施，但仍然不能根除紅火蟻。而且長期用化學藥劑對紅火蟻進行控制，會導致意想不到的反彈。

發明內容

為了解決現有技術的不足，本發明利用飼喂dsRNA方法分別干擾紅火蟻工蟻CYP6A1-like和CYP4C1-like兩個P450基因，并檢測紅火蟻工蟻對外源化合物的的敏感度和酶活性的變化，進一步明確CYP6A1和CYP4C1的解毒代謝功能。

本發明的技術方案是：一種利用RNA干擾防治紅火蟻的方法，向紅火蟻飼喂制得的dsRNA。

本發明的進一步改進包括：

向飼喂過dsRNA的紅火蟻施用氟蟲腈和/或毒死蜱。

所述的dsRNA是dsCYP6A1-like和/或dsCYP4C1-like。

本發明的另一目的在于提供一種制備上述dsRNA的方法，通過dsCYP6A1-like和dsCYP4C1-like的CDs區域來設計合成dsRNA。

本發明還提供了dsCYP6A1-like在降低紅火蟻對氟蟲腈抗藥性中的應用。

附圖說明

圖1是以dsGFP(288bp)，dsCYP6A1-like(376bp)和dsCYP4C1-like(419bp)為靶基因的dsRNA合圖。

圖2a是RNAi介導的dsCYP6A1-like對CYP6A1-like和CYP4C1-like mRNA的沉默效果檢測。

圖2b是RNAi介導的dsCYP4C1-like對CYP6A1-like和CYP4C1-like mRNA的沉默效果檢測。

圖3a是RNAi介導的dsCYP6A1-like對其它P450mRNA的影響檢測。

圖3b是RNAi介導的dsCYP4C1-like對其它P450mRNA的影響檢測。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明做詳細說明。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源和飼養

供試紅火蟻采自廣東廣州五山。參照Kuriachan等方法，用大塑料桶從田間采回紅火蟻蟻群，放置1-2d，待蟻群在桶內建立了新的群落后，將自來水緩慢滴入桶內，令紅火蟻從群落中自動上移、浮出。用40目的撈網將蟻群轉入盆口涂以爽身粉的塑料盆(7.0L)中，在室內(室溫25℃,RH 65％-80％)用人工飼料飼養一周后供試驗用。工蟻、兵蟻、有翅雄蟻、有翅雌蟻和蟻后和幼蟻的判斷標準參考曾玲等(2005)方法。

1.2 主要試劑

TRIzol Reagent，Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG Kit。

La Taq聚合酶，PrimeScript 1st strand cDNA synthesize kit，DNase I(Takara)。

QIAquick PCR產物回收試劑盒。

RNAi試劑盒。

1.3 主要儀器