[發(fā)明專利]間充質干細胞中MACF1基因條件性敲除小鼠模型的建立及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710008830.2
• 申請日: 2017-01-06
• 公開（公告）號: CN107047452A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設計）人: 騫愛榮;馬小莉;胡麗芳;趙帆;張茹;仇伍霞;王牌;蘇佩紅;陳志浩;李迪杰;印崇;苗治平;陳蕾
• 申請（專利權）人: 西北工業(yè)大學
• 主分類號: A01K67/02
• 分類號: A01K67/02
• 代理公司: 西北工業(yè)大學專利中心61204
• 代理人: 王鮮凱

技術領域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領域，特別涉及一種間充質干細胞中MACF1基因條件性敲除小鼠模型的建立及其應用。

背景技術

間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)，是一種具有自我復制能力和多向分化潛能的成體干細胞，這種干細胞能夠分化成硬骨、軟骨、脂肪和其他類型的細胞。而始于間充質干細胞的硬骨形成過程在骨構建、骨重建及骨折愈合中扮演著重要的角色。如果間充質干細胞骨形成能力降低，必然導致相應骨骼疾病的發(fā)生，例如骨骼發(fā)育延遲、骨不連、骨折愈合延遲、骨質疏松癥等骨形成障礙性疾病。然而骨形成障礙是一個比較復雜的過程，其相關的分子機理目前還不十分清楚。

微管微絲交聯(lián)因子MACF1，又名ACF7，是一種新型的細胞骨架交聯(lián)分子，在細胞極化、細胞遷移、信號轉導以及維持組織的完整性中發(fā)揮著重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，MACF1與模擬失重條件下骨形成細胞中的微管微絲交聯(lián)發(fā)生改變相關(Qian AR,et al.[J].Bioelectromagnetics,2009Oct.30(7):545–555)；而且，在MACF1穩(wěn)定低表達的MC3T3-E1前成骨細胞株中，MACF1低表達影響前成骨細胞的形態(tài)、抑制前成骨細胞的增殖(Hu LF,etal.[J].BMB Rep.2015Oct.48(10):583-8.)。

可見，MACF1在骨形成中具有重要的作用，只是目前關于MACF1對骨形成作用的研究還非常少，只限于細胞水平。而細胞水平的實驗研究僅僅基于離體細胞本身的微小環(huán)境，忽視了生命體本身的整體環(huán)境及各組織系統(tǒng)間的協(xié)調(diào)互作。因此，在細胞水平上不能直觀全面地研究MACF1在骨形成中的作用。而且，基于現(xiàn)有研究技術，對于MACF1在骨骼中功能的研究，僅構建有在前成骨細胞系MC3T3-E1中使MACF1低表達的穩(wěn)定細胞株(騫愛榮等.抑制小鼠MACF1基因表達的shRNA序列及其應用[P].北京：CN 104531700A,20150422.)。

發(fā)明內(nèi)容

為了彌補骨形成研究領域內(nèi)MACF1基因在間充質干細胞中條件性敲除動物模型的空缺，以在動物水平研究MACF1對骨形成的作用，本發(fā)明提供一種間充質干細胞中MACF1基因條件性敲除小鼠模型的建立及其應用。利用Cre-Loxp系統(tǒng)，通過MACF1^flox/flox小鼠與Cre酶僅在間充質干細胞中特異性表達的Prrx1^Cre小鼠交配，最終獲得Prrx1^Cre；MACF1^flox/flox小鼠，成功獲得間充質干細胞中MACF1基因條件性敲除的小鼠模型。所述動物模型的MACF1基因條件性失活，造成所述動物模型中新生小鼠的顱骨發(fā)育延遲、成年小鼠的骨形成能力降低，是一種骨骼發(fā)育延遲、骨形成能力降低的小鼠動物模型。該模型可以作為研究MACF1基因在骨骼發(fā)育及骨形成中功能的動物模型；同時還可用于研究顱骨發(fā)育不全以及骨質疏松癥等骨形成障礙性疾病的發(fā)病機制，并用于篩選改善或治療此類疾病的候選物質，具有重要的應用價值。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案：一種間充質干細胞中MACF1基因條件性敲除小鼠模型的建立方法，其特點是包括以下步驟：

(1)選用MACF1^flox/+小鼠自交，擴繁獲得純合子MACF1^flox/flox小鼠；

(2)選用Prrx1^Cre轉基因小鼠與SPF級C57BL/6J小鼠交配，擴繁獲得Prrx1^Cre轉基因小鼠；

(3)將獲得的MACF1^flox/flox小鼠與獲得的Prrx1^Cre轉基因小鼠交配，獲得半敲Prrx1^Cre；MACF1^flox/+小鼠；

(4)將獲得的半敲Prrx1^Cre；MACF1^flox/+小鼠自交，獲得間充質干細胞中條件性敲除基因MACF1小鼠模型，即全敲Prrx1^Cre；MACF1^flox/flox小鼠。

(5)對所得到的MACF1^flox/flox小鼠、Prrx1^Cre小鼠以及Prrx1^Cre；MACF1^flox/flox小鼠利用特異性引物通過PCR方法進行基因型的鑒定。

所述特異性引物為一對時，首選