[發明專利]一種睪丸間質干細胞分離培養分化方法

在審

• 申請號: 201710007766.6
• 申請日: 2017-01-05
• 公開（公告）號: CN106754684A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 曹暉;孫振華
• 申請（專利權）人: 厚樸生物科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種睪丸間質干細胞分離培養分化方法。

背景技術

當前干細胞相關技術及成果不斷涌現，干細胞研究正在經歷一場轟轟烈烈的研究熱潮。包括胚胎干細胞、誘導性多能干細胞及成體干細胞在內的多種干細胞研究都取得了巨大的進展。成體干細胞因其低免疫原性及與體細胞較高的分化相似度使得其在臨床應用中獲得了更多的親睞。骨髓間質干細胞在20多年前就進入了研究人員的視野中，脂肪間質干細胞等今年來也取得了豐碩的成果和長足的進展。動物睪丸中蘊含了大量的干細胞，除雄性生殖干細胞外，睪丸間質干細胞也是極為重要的可利用的干細胞資源。然而，睪丸中的間質干細胞的分離、培養、分化方法仍然缺乏。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種睪丸間質干細胞分離培養分化方法，采用通過對睪丸組織進行分離培養分化，解決了睪丸中的間質干細胞的分離、培養、分化方法的空缺。

為達到上述目的，本發明的技術方案如下：一種睪丸間質干細胞分離培養分化方法，包括以下步驟：

步驟1，對取得的睪丸組織體外進行分離、培養、擴增；

步驟2，將P4代細胞進行培養，形成類胚體；

步驟3，將類胚體進行接種分化。

作為本發明的進一步改進，所述步驟1對取得的睪丸組織體外進行分離的方法為：將取得的睪丸組織用胰蛋白酶和DNase進行消化，再用等體積的DMEM/F12和濃度為10％FBS溶液終止酶消化，在室溫下300g*5min離心，棄上清；用5mL DMEM/F12和濃度為10％FBS溶液重懸細胞，室溫300g*5min離心，棄上清。

作為本發明的進一步改進，所述步驟1對取得的睪丸組織體外進行分離的方法為：將取得的睪丸組織用2mg/mL膠原酶、20μg/mL DNase和2mg/mL分解酶消化20min，之后用1mg/mL胰蛋白酶和10μg/mL DNase消化10min，再用等體積的DMEM/F12加10％FBS溶液終止酶消化，在室溫下300g*5min離心，棄上清；用5mL DMEM/F12加10％FBS溶液重懸細胞，室溫300g*5min離心，棄上清。

作為本發明的進一步改進，步驟1中對取得的睪丸組織體外進行培養、擴增的方法為：用5mL DMEM/F12加10％FBS重懸細胞，調整細胞密度，按照100cells/60mm皿接種細胞，用DMEM/F12加10％FBS培養，6d后取間質干細胞，重新接種于新的24孔板上，進行培養擴增。

作為本發明的進一步改進，步驟2，將步驟1中培養狀態良好的P4代細胞經0.25％胰蛋白酶消化、300g*5min離心后，用PBS緩沖液重懸，300g*5min進行離心；用DMEM/F12加10％FBS重懸細胞，血細胞計數板計數，調整細胞密度，制成800～1000cells/25uL的小滴，倒置培養3天，形成類胚體。

作為本發明的進一步改進，步驟3，將步驟2中制備好的類胚體接種于48孔板中，每孔中接種1個類胚體，用DMEM/F12加20％FBS使類胚體自發分化7d，之后檢測三胚層分化效果。

作為本發明的進一步改進，對步驟1中正在培養的細胞進行免疫熒光染色：用4％PFA室溫固定15分鐘，然后PBS洗三遍；用0.2％Triton X－100通透10分鐘，PBS洗三遍；用1％BSA室溫封閉30分鐘，一抗4度過夜，PBS洗三遍；二抗室溫1小時，PBS洗三遍；用5ug/mL Hoechst33342室溫染核5min，PBS洗三遍，直接熒光下照相記錄。

作為本發明的進一步改進，對步驟2中形成的類胚體進行成骨誘導分化或脂肪誘導。

通過上述技術方案，本發明技術方案的有益效果是：研究證實，本發明能夠有效獲得睪丸間質干細胞，所得干細胞具有間質干細胞的典型形態；表達間質干細胞的有效標記如：CD29、CD166等；表達干細胞標記如：OCT4、NANOG等；能形成EB，誘導后能向脂肪、成骨等細胞分化。證實本發明可以有效獲得睪丸間質干細胞，并進行誘導分化。本發明方法簡單有效，通過將睪丸組織酶解成單細胞懸液后以極低的密度在DMEM/F12+10％FBS中培養，有效獲得睪丸間質干細胞，并能將其誘導分化成脂肪、成骨等細胞，可控性強。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。