[發(fā)明專利]一種氧化酶及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710006591.7
• 申請日: 2017-01-05
• 公開（公告）號: CN106754791B
• 公開（公告）日: 2019-11-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡宇杰;武旭攀;曹憬;白亞軍;鄭曉暉
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12P7/40;C12P7/50;C12P41/00;C12P7/62
• 代理公司: 23211 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 彭素琴<國際申請>=<國際公布>=<進(jìn)入

本發(fā)明涉及一種來源于雷氏普羅威登斯菌(Providencia rettgeri)的D?乳酸氧化酶基因的獲得及其克隆表達(dá)，屬于生物工程領(lǐng)域。公開了其底物特異性，同時該D?乳酸氧化酶可以氧化(R)?α?羥酸酯，可應(yīng)用于光學(xué)純(S)?α?羥酸酯的制備。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明克隆表達(dá)了一種D-乳酸氧化酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用，屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)

D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一種以FAD(FMN)為輔酶的α-羥酸氧化酶(習(xí)慣上均稱之為D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物傳感器中測定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生產(chǎn)丙酮酸。也有被用于光學(xué)純α-羥酸的制備(中國專利201210109290.4)

目前為止，已經(jīng)在遲鈍愛德華菌(Edwardsiella tarda)和運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)等中發(fā)現(xiàn)了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N, Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis: evidence for abranched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998, 168(1):91-97)

本發(fā)明首次從雷氏普羅威登斯菌(Providencia rettgeri)中克隆表達(dá)出一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶不僅可以氧化(R)-α-羥酸，而且可以氧化(R)-α-羥酸酯，該反應(yīng)與NAD(NADP)為輔酶的乳酸脫氫酶參與的反應(yīng)相比逆反應(yīng)極微弱，可應(yīng)用于光學(xué)純(S)-α-羥酸酯和(S)-α-羥酸的制備。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明從雷氏普羅威登斯菌(Providencia rettgeri)中克隆得到了一種以 FAD為輔酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達(dá)，公開了其相關(guān)的酶學(xué)特性，并進(jìn)行了應(yīng)用研究。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1、菌株

本發(fā)明D-乳酸氧化酶基因的來源菌株為：Providencia rettgeri ATCC 29944，購自美國ATCC菌種庫。

2、D-乳酸氧化酶基因的克隆

提取Providencia rettgeri ATCC 29944菌體基因組總DNA。設(shè)計特異性引物，應(yīng)用PCR方法，擴(kuò)增出D-乳酸氧化酶基因全長編碼框序列。并構(gòu)建重組質(zhì)粒。

3、D-乳酸氧化酶表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。

4、D-乳酸氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

以D-乳酸為底物研究pH對本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。

以D-乳酸為底物研究溫度對本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。

D-乳酸氧化酶的底物特異性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-對羥基苯乳酸、D-酒石酸、D-蘋果酸、D-扁桃酸、D-丹參素。

酶活測定方法為：根據(jù)Characterization of a Lactate Oxidase from aStrain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry andBiotechnology,56, 1996,278-288。所述方法進(jìn)行。

5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羥酸酯