[發明專利]一種氧化酶及其應用

在審

• 申請號: 201710006561.6
• 申請日: 2017-01-05
• 公開（公告）號: CN106754785A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 蔡宇杰;沈天成;馮佳婷;白亞軍;鄭曉暉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12P7/40;C12P7/50;C12P41/00;C12P7/62
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種來源于豪氏變形桿菌(Proteus hauseri)的L?α?羥酸氧化酶基因的獲得及其克隆表達，屬于生物工程領域。公開了其底物特異性，同時該L?α?羥酸氧化酶可以氧化(S)?α?羥酸酯，可應用于光學純(R)?α?羥酸酯的制備。

技術領域

本發明克隆表達了一種L-α-羥酸氧化酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學性質和應用，屬于工業微生物領域。

背景技術

L-α-羥酸氧化酶(L-α-hydroxyacid oxidase)是一種以FMN(FAD)為輔酶的脫氫酶(Aliphatic l-α-hydroxyacid oxidase from rat livers purification andproperties. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Enzymology 1968,167:9-22)，通常包含有乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase)(Preparation and some properties ofcrystalline glycolic acid oxidase of spinach.J.Biol.Chem.1958,231(1):135–57)、L-乳酸氧化酶(L-lactate oxidase)(Conversion of L-lactate oxidase to a longchain alpha- hydroxyacid oxidase by site-directed mutagenesis of alanine 95toglycine.J Biol Chem.1996 8；271(45):28300-28305)?？捎糜谏飩鞲衅髦袦y定乳酸的含量，或氧化L-乳酸生產丙酮酸。也有被用于光學純α-羥酸的制備(中國專利201210109290.4)

目前為止，已經在惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，綠色氣球菌(Aerococcus viridians)，鏈球菌屬(Streptococcus sp.)，片球菌屬 (Pediococcussp.)，乳酸乳球菌(Lactococus lactis)，遲鈍愛德華菌 (Edwardsiella tarda)，恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis),運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)和過氧化醋桿菌(Acetobacter peroxidans)等細菌中克隆表達得到了L-乳酸氧化酶。L-乳酸氧化酶也在一些真菌中檢測到，例如白地霉(Geotrichum candidum)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。 (Search for Lactate Oxidase Producer Microorganisms，AppliedBiochemistry and Microbiology,2007,43(2)178–181)

本發明首次從Kerstersia gyiorum DSM 16618中克隆表達出一種新型的L- α-羥酸氧化酶，該酶不僅可以氧化(S)-α-羥酸，而且可以氧化(S)-α-羥酸酯，可應用于光學純(R)-α-羥酸酯和(R)-α-羥酸的制備。

發明內容

本發明從豪氏變形桿菌(Proteus hauseri)中克隆得到了一種L-α-羥酸氧化酶的基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達，公開了其相關的酶學特性，并進行了應用研究。

本發明的技術方案如下：

1、菌株

本發明L-α-羥酸氧化酶基因的來源菌株為：Proteus hauseri ATCC 13315，購自美國ATCC菌種庫。

2、L-α-羥酸氧化酶基因的克隆

提取Proteus hauseri ATCC 13315菌體基因組總DNA。設計特異性引物，應用PCR方法，擴增出L-α-羥酸氧化酶基因全長編碼框序列。并構建重組質粒。

3、L-α-羥酸氧化酶表達與純化