[發(fā)明專利]一種基于融合光譜技術(shù)的食源性致病微生物檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710006284.9
• 申請(qǐng)日: 2017-01-05
• 公開（公告）號(hào): CN106706595B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳全勝;李歡歡;趙杰文;歐陽琴;郭志明;林顥;劉妍;孫浩;楊明秀
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/65
• 分類號(hào): G01N21/65;G01N21/359;G01N21/3563
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• 代理人: 暫無信息

1.一種基于顯微多模態(tài)融合光譜技術(shù)的食源性致病微生物檢測(cè)方法，其特征在于，以食源性致病微生物為研究對(duì)象，構(gòu)建檢測(cè)平臺(tái)，用于食源性致病微生物的快速高通量檢測(cè)，通過拉曼光譜和近紅外光譜技術(shù)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)；首先，在顯微拉曼光譜獨(dú)立模式下，制備增強(qiáng)基底結(jié)合標(biāo)記分子、特異性識(shí)別分子構(gòu)建生物標(biāo)記納米探針，利用所制備生物標(biāo)記納米探針，對(duì)微生物進(jìn)行特異性標(biāo)記，采集不同濃度食源性致病菌菌液的拉曼光譜；隨后，在顯微近紅外光譜模式下，采集不同菌液的近紅外光譜信號(hào)，利用智能搜索及數(shù)據(jù)降維手段挖掘出與菌液密切相關(guān)的特征變量，與拉曼標(biāo)記峰相融合，建立融合光譜強(qiáng)度與菌液濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定食品中食源性微生物的檢測(cè)限，實(shí)現(xiàn)基于融合光譜技術(shù)的食源性微生物特異性定量檢測(cè)；

所構(gòu)建檢測(cè)平臺(tái)是近紅外光譜技術(shù)、拉曼光譜技術(shù)和顯微成像技術(shù)的交叉融合，既可獲取微觀尺度上的光譜信息，還可分辨微觀層面上的細(xì)微特征，實(shí)現(xiàn)不同技術(shù)之間的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，設(shè)備在研制過程將在顯微拉曼光譜技術(shù)和顯微近紅外光譜技術(shù)的有機(jī)集成方法、激光激發(fā)光源模組、系統(tǒng)平臺(tái)多模態(tài)切換方式等方面實(shí)現(xiàn)突破性研究；

所述數(shù)據(jù)降維手段主要通過目標(biāo)導(dǎo)向篩選出幾個(gè)最優(yōu)區(qū)間組合，剔除全光譜區(qū)域內(nèi)大量與檢測(cè)目標(biāo)無關(guān)的變量；接著，應(yīng)用智能搜索方法，從最優(yōu)區(qū)間組合中對(duì)變量進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)選，剔除相鄰波長間具有高度共線性的冗余變量，從而優(yōu)選出特定尺度下的特征光譜變量；

所述檢測(cè)方法包括如下具體實(shí)現(xiàn)過程：

1)食源性致病微生物樣本準(zhǔn)備：首先將微生物的菌株分別接于Luria-Bertani培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)24h，然后以轉(zhuǎn)速5000g離心5min，棄上清液，并用超純水清洗三次，分別重新分散于超純水；最后將所獲得的細(xì)菌菌液分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，獲得8個(gè)梯度的菌液儲(chǔ)存?zhèn)溆茫瑫r(shí)采用菌落平板計(jì)數(shù)法分別確定細(xì)菌具體的菌落數(shù)量；

2)增強(qiáng)基底制備：增強(qiáng)基底金納米棒的合成是利用種子生長法，在十六烷基三甲基溴化銨CTAB膠束水溶液中加入硝酸銀；混合物反應(yīng)20min，直到顏色變成紅葡萄酒；隨后，將硫酸鈉加入至混合溶液中進(jìn)行進(jìn)一步生長；最終，將硫化處理后的金納米棒收集離心，用純水洗三次，最后分散在超純水儲(chǔ)存在4℃的進(jìn)一步使用；

3)拉曼光譜采集：利用所制備生物標(biāo)記納米探針，對(duì)微生物進(jìn)行特異性標(biāo)記，在150cm^-1-2000cm^-1波長范圍內(nèi)采集不同濃度食源性致病菌菌液的拉曼光譜信號(hào)；

4)近紅外光譜采集：在顯微拉曼光譜獨(dú)立模式下，采集不同濃度食源性致病菌菌液的近紅外光譜信號(hào)；

5)數(shù)據(jù)處理及分析：采集不同菌液的近紅外光譜信號(hào)后，利用智能搜索及數(shù)據(jù)降維手段挖掘出與菌液密切相關(guān)的特征變量，與拉曼標(biāo)記峰相融合，建立融合光譜強(qiáng)度與菌液濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定食品中食源性微生物的檢測(cè)限，實(shí)現(xiàn)基于融合光譜技術(shù)的食源性微生物特異性定量檢測(cè)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于顯微多模態(tài)融合光譜技術(shù)的食源性致病微生物檢測(cè)方法，其特征在于，所制備增強(qiáng)基底是采用種子生長法，以十六烷基三甲基溴化銨CTAB和含有雙鍵的陰離子十二烷基苯基磺酸鈉SDBS作為表面活性劑膠束模板，在可溶性金源、可溶性銀鹽、抗壞血酸、硼氫化鈉共同存在的酸性條件下，經(jīng)過陳化，得到金納米棒增強(qiáng)基底；制備過程中，通過調(diào)節(jié)不同表面活性劑濃度，考察其對(duì)金納米棒尺寸、形貌、長徑比、光學(xué)性質(zhì)對(duì)表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)的影響；最終，將優(yōu)化后SERS基底的形貌、等離子體共振吸收LSPR進(jìn)行表征。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于顯微多模態(tài)融合光譜技術(shù)的食源性致病微生物檢測(cè)方法，其特征在于，所述的食源性致病微生物至少包含大腸桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、布魯氏菌、空腸彎曲菌、沙門氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、霍亂弧菌。