[發明專利]一種人血清中非Gal異種抗體檢測方法

有效

• 申請號: 201710004610.2
• 申請日: 2017-01-04
• 公開（公告）號: CN106841634B
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 牟麗莎;蔡志明;趙成江;葉學軍
• 申請（專利權）人: 深圳市第二人民醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

本發明公開了一種人血清中非Gal異種抗體檢測方法，用于豬器官移植到人體的異種器官移植中受體人中抗供體豬非Gal抗原的抗體的檢測，所述方法包括：按照10⁵個細胞與100μL人血清的比例，使αGal敲除的基因敲除豬的外周血單核細胞與人血清混合孵育3小時檢測IgM，孵育6小時檢測IgG。本發明的人血清中非Gal異種抗體檢測方法，提高流式檢測非Gal抗原結合人異種抗體的靈敏性、準確性和可重復性，有助于篩選非Gal表達抗原低表達的供體豬。

技術領域

本發明涉及異種器官移植技術領域，尤其涉及一種人血清中非Gal異種抗體檢測方法，用于豬器官移植到人體的異種器官移植中受體人中抗供體豬非Gal抗原的抗體的檢測。

背景技術

器官短缺是制約臨床大規模開展器官移植手術的重要瓶頸。使用豬的器官作為替代，是解決這一難題的潛在方案[1]。包括人在內的靈長類動物的血清中存在針對豬蛋白的天然抗體，可以識別豬細胞上的異種抗原，介導了對異種移植物的排斥，引發超急性排斥反應。人血清中識別豬抗原的異種抗體主要目標是αGal，人體內循環的IgG中約1％是抗αGal抗原的。GTKO豬的出現緩解了由αGal引發的超急性排斥反應，延長了移植物的存活時間。

敲除αGal抗原并不能完全避免超急性排斥，原因之一是還存在其它的異種抗原能夠被靈長類動物血清中的天然異種抗體所識別，例如Neu5GC和Sd^a抗原。因此，檢測移植受體內抗非Gal抗原抗體的水平是非常重要的，可能會影響異種器官的存活時間。已有的異種移植研究中，利用豬的外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)檢測血清中的異種抗體水平是很常用的方法，一般采用4℃孵育30分鐘。這一方法對于抗αGal抗體是足夠靈敏的。這是由于人血清中含有大量的抗αGal抗體，而抗非Gal抗體的豐度遠遠低于抗αGal抗體，因此在測定非Gal抗原水平時有必要提高檢測方法的靈敏度，并細化檢測方法。目前針對非Gal抗原檢測，還沒有一個統一的標準，不同實驗間也無法作比較。

發明內容

本發明提供一種人血清中非Gal異種抗體檢測方法，提高流式檢測非Gal抗原結合人異種抗體的靈敏性、準確性和可重復性。

一種人血清中非Gal異種抗體檢測方法，用于豬器官移植到人體的異種器官移植中受體人中抗供體豬非Gal抗原的抗體的檢測，上述方法包括：按照10⁵個細胞與100μL人血清的比例，使αGal敲除的基因敲除豬的外周血單核細胞與人血清混合孵育3小時檢測IgM，孵育6小時檢測IgG。

進一步地，上述αGal敲除的基因敲除豬是GGTA1敲除的基因敲除豬。

進一步地，上述αGal敲除的基因敲除豬是GGTA1敲除的五指山豬。

進一步地，上述人血清是混合的健康人血清。使用混合的健康人血清，能夠消除由個別血清帶來的檢測結果的偶然性。

進一步地，上述孵育在4℃下進行。

進一步地，上述孵育后，使用異種血清封閉，然后使用抗人的熒光標記的抗體孵育，再使用流式細胞儀檢測外周血單核細胞上結合的IgM和/或IgG的水平。

進一步地，上述異種血清是滅活的山羊血清。

進一步地，上述抗人的熒光標記的抗體是異硫氰酸熒光素標記的山羊抗人IgG或IgM。

進一步地，上述使用異種血清封閉是在4℃封閉20分鐘。

進一步地，上述使用抗人的熒光標記的抗體孵育是在4℃避光孵育30分鐘。

本發明的人血清中非Gal異種抗體檢測方法，提高流式檢測非Gal抗原結合人異種抗體的靈敏性、準確性和可重復性，有助于篩選非Gal表達抗原低表達的供體豬。

附圖說明