[發明專利]液相色譜-串聯質譜法檢測組織亞油酸含量的方法及結直腸癌診斷試劑盒

有效

• 申請號: 201710002126.6
• 申請日: 2017-01-03
• 公開（公告）號: CN106872590B
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發明（設計）人: 張健;李劍英;孫茂;陳蘇寧
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 范巍

1.一種液相色譜-串聯質譜法檢測組織亞油酸含量的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)將50～110mg組織樣本在液氮中研磨成粉，將研磨得到的組織粉末用含有0.1％2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的冰甲醇均質后進行離心，取離心得到的上清液；

2)向15～20μL上清液中加入亞油酸同位素內標，放置25～35min后離心，將離心得到的上清液經氮氣吹干后用50～60μL正丁醇于60～65℃衍生處理20～30min，然后氮氣吹干，用100～150μL流動相重新分散溶解，得到待上樣檢測樣品；

3)對待上樣檢測樣品利用液相色譜-串聯質譜法進行分析，得到組織樣本中亞油酸的含量；

所述液相色譜的工作條件包括：流動相是將0.6～1mL 50％的乙酸水溶液與1000mL乙腈水溶液混合而制成的，所述乙腈水溶液中乙腈與水的體積比為(7～8):(2～3)；流動相采用梯度流速。

2.根據權利要求1所述一種液相色譜-串聯質譜法檢測組織亞油酸含量的方法，其特征在于：所述組織樣本由腸道活檢得到。

3.根據權利要求1所述一種液相色譜-串聯質譜法檢測組織亞油酸含量的方法，其特征在于：所述冰甲醇是指0～4℃預冷的甲醇。

4.根據權利要求1所述一種液相色譜-串聯質譜法檢測組織亞油酸含量的方法，其特征在于：所述液相色譜中初始流速為240μL/min；進樣量為18～25μL。

5.根據權利要求1所述一種液相色譜-串聯質譜法檢測組織亞油酸含量的方法，其特征在于：所述質譜的工作條件包括：離子源溫度為350～370℃；每次轉變駐留時間為200～220ms；霧化氣為0.3MPa，輔助氣為0.4MPa，氣簾氣為0.25MPa；分析模式為母離子掃描，目標物亞油酸的母離子掃描范圍為350～500m/z，子離子為85.1m/z。

6.一種結直腸癌診斷試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括用于提取組織液的試劑以及用于制備液相色譜-串聯質譜法所需樣品的預處理試劑和流動相，所述用于提取組織液的試劑包括2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚以及甲醇，所述預處理試劑包括亞油酸同位素內標以及衍生試劑正丁醇；所述流動相是將0.6～1mL 50％的乙酸水溶液與1000mL乙腈水溶液混合而制成的，所述乙腈水溶液中乙腈與水的體積比為(7～8):(2～3)。

7.根據權利要求6所述一種結直腸癌診斷試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括用于實時定量PCR檢測組織樣本中FADS1、FADS2、ELOVL2或ELOVL5基因表達量的對應引物對P1、P2、P3或P4。

8.根據權利要求7所述一種結直腸癌診斷試劑盒，其特征在于：

所述引物對P1為：

上游引物FADS1F：5`-GTCCGCTTCTTCCTCACTTATG-3`

下游引物FADS1R：5`-GCTTTCCAGGAACCTGACTATG-3`；

所述引物對P2為：

上游引物FADS2F：5`-CATGACCATGATCGTCCATAAGA-3`

下游引物FADS2R：5`-GATGCCGTAGAAAGGGATGTAG-3`；

所述引物對P3為：

上游引物ELOVL2F：5`-CCCTTCGGTTGTCTCATCTTC-3`

下游引物ELOVL2R：5`-CAGGTGGCTCTTGCATATCTT-3`；

所述引物對P4為：

上游引物ELOVL5F：5`-TCCCTCTTGGTTGGTTGTATTT-3`

下游引物ELOVL5R：5`-CCTTCAGGTGGTCTTTCCTTC-3`。