[發(fā)明專(zhuān)利]熱穩(wěn)定的Cas9核酸酶在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201680092098.5 | 申請(qǐng)日： | 2016-12-14 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN110312792A | 公開(kāi)（公告）日： | 2019-10-08 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 約翰·萬(wàn)德奧斯特;理查德·范克拉嫩堡;艾勒克·芬納·博斯馬;揚(yáng)尼斯·莫加科斯 | 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人： | 瓦赫寧根大學(xué);科學(xué)技術(shù)基金會(huì) |
| 主分類(lèi)號(hào)： | C12N9/22 | 分類(lèi)號(hào)： | C12N9/22;C12N15/113 |
| 代理公司： | 北京安信方達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11262 | 代理人： | 李敏春;鄭霞 |
| 地址： | 荷蘭瓦*** | 國(guó)省代碼： | 荷蘭;NL |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 核酸酶 蛋白 多肽片段 熱穩(wěn)定 多肽 雙鏈靶多核苷酸 遺傳工程領(lǐng)域 氨基酸序列 基因組修飾 生物體 表達(dá)載體 核酸分子 宿主細(xì)胞 新型工具 遺傳操作 同一性 核酸 裂解 修飾 微生物 升高 | ||
1.至少一種靶向RNA分子和Cas蛋白用于結(jié)合、裂解、標(biāo)記或修飾包含靶核酸序列的雙鏈靶多核苷酸的用途，其中：
所述雙鏈靶多核苷酸包含靶核酸鏈和非靶核酸鏈，所述靶核酸鏈包含所述靶核酸序列，所述非靶核酸鏈包含與所述靶核酸序列互補(bǔ)的前間區(qū)核酸序列；
所述Cas蛋白具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或與SEQ ID NO:1具有至少77％同一性的序列；
所述至少一種靶向RNA分子識(shí)別所述靶序列；
所述非靶核酸鏈還包含與所述前間區(qū)核酸序列的3’末端直接地相鄰的前間區(qū)相鄰基序(PAM)序列，其中所述PAM序列包含5’-NNNNCNN-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述結(jié)合、裂解、標(biāo)記或修飾發(fā)生在20℃和100℃之間的溫度、30℃和80℃之間的溫度、37℃和78℃之間的溫度，優(yōu)選地55℃以上的溫度；更優(yōu)選地55℃和80℃之間的溫度；甚至更優(yōu)選地55℃和65℃之間的溫度或60℃和65℃之間的溫度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的用途，其中包含所述靶核酸序列的所述多核苷酸被所述Cas蛋白裂解，優(yōu)選地其中所述裂解是DNA裂解。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的用途，其中包含所述靶序列的所述靶核酸鏈?zhǔn)请p鏈DNA，并且所述用途引起包含所述靶核酸序列的所述多核苷酸中的雙鏈斷裂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的用途，其中包含所述靶核酸序列的所述多核苷酸是雙鏈DNA，所述Cas蛋白缺乏切割所述雙鏈DNA的能力，并且所述用途引起所述多核苷酸的基因沉默。
6.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述PAM序列包含5’-NNNNCNNA-3’、5’-CNNNCNN-3’、5’-NNNCCNN-3’、5’-NNCNCNN-3’、5’-NNNNCCN-3’、和/或5’-NCNNCNN-3’。
7.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述PAM序列包含5’-CCCCCCNA-3’[SEQID NO:10]，優(yōu)選地其中所述PAM序列包含5’-CCCCCCAA-3’[SEQ ID NO:11]。
8.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述Cas蛋白從細(xì)菌、古核生物或病毒，優(yōu)選地從嗜熱細(xì)菌可獲得。
9.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述Cas蛋白從地芽孢桿菌屬的種(Geobacillus sp.)，優(yōu)選地從熱脫氮地芽孢桿菌(Geobacillus thermodenitrificans)可獲得。
10.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述靶向RNA分子包含crRNA和tracrRNA。
11.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述至少一種靶向RNA分子的長(zhǎng)度是在35-200個(gè)核苷酸殘基的范圍中。
12.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述靶核酸序列的長(zhǎng)度是從15個(gè)至32個(gè)核苷酸殘基。
14.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的用途，其中所述Cas蛋白作為蛋白復(fù)合體的一部分被提供，所述蛋白復(fù)合體包含至少一種另外的功能蛋白或非功能蛋白，任選地其中所述至少一種另外的蛋白還包含至少一個(gè)功能部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或權(quán)利要求14所述的用途，其中所述Cas蛋白或另外的蛋白包含與所述Cas蛋白或蛋白復(fù)合體的N-末端和/或C-末端，優(yōu)選地C-末端融合或連接的至少一個(gè)功能部分。
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