[發明專利]一種高產cAMP的酵母菌株及其應用

有效

• 申請號: 201680081730.6
• 申請日: 2016-02-18
• 公開（公告）號: CN108699547B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 鄒少蘭;高文萱;胡蕓;楊順華;馬平生
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N1/16;C12R1/645
• 代理公司: 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 劉玉玲

本發明提供一種能過量合成胞外cAMP的酵母菌株及其構建方法、發酵工藝與在醫藥、畜牧業、食品或化工領域中的應用。所述酵母菌株包括第一種和第二種基因修飾，其中，所述第一種基因是蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)催化亞基編碼基因TPK1，TPK2和TPK3，通過修飾第一種基因使PKA活性或表達被完全抑制，從而消除對環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的反饋抑制，但同時使得酵母的生長被抑制，第二種基因修飾消除了第一種基因修飾導致的生長抑制，從而使得酵母能夠正常生長，所述酵母的cAMP產量上升，其中，所述cAMP產量上升，是相對于未經基因修飾的酵母的cAMP產量而言。所述酵母菌株還包括第三種和/或第四種基因修飾。本發明的重組酵母菌株能穩定、持續、高效生產胞外cAMP，可達9721.6μmol/L。

技術領域

本發明屬于基因工程和微生物發酵技術領域，具體涉及一種能過量合成胞外cAMP的酵母菌株及其構建方法、發酵工藝與在醫藥、畜牧業、食品或化工領域中的應用。

背景技術

環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，簡稱cAMP)是人體內廣泛存在的一種具有生理活性的重要物質，其作為細胞內的第二信使，對糖代謝、脂肪代謝、核酸合成、蛋白質合成等起著重要的調節作用。目前cAMP在醫藥方面用途廣泛：臨床上cAMP用于治療心絞痛、心肌梗死、心肌炎及心源性休克等；對改善風濕性心臟病的心悸、氣急、胸悶等癥狀有一定的作用；可提高急性白血病結合化療的療效，亦可用于急性白血病的誘導緩解；此外，對老年慢性支氣管炎、各種肝炎和銀屑病也有一定療效。cAMP也可作為藥物中間體制備二丁酰環磷腺苷和環磷腺苷葡甲胺，提高脂溶性，從而發揮更有效的生理及藥理作用。cAMP還可用作畜禽食品添加劑，在離體條件下模擬生長激素的作用，促進畜禽生長，增加優質禽產品產量。

cAMP的生產方法有化學合成法、酶促轉化法和發酵法三種。目前國內外產業化生產全部采用以腺苷一磷酸(Adenosine-5’-monophosphate，簡稱AMP)為原料的化學合成法，其采用高效分離柱進行中間體分離，操作復雜，且所涉及的試劑昂貴，采用大量的吡啶作為溶劑也造成嚴重的環境污染。酶促轉化法即以腺苷酸環化酶(E.C.4.6.1.1，Cyr1p)為酶源催化ATP原料一步生產cAMP，但此法存在底物昂貴、腺苷酸環化酶含量低、純化困難、穩定性差等限制，故目前還局限于實驗室階段，離產業化還有相當的距離。相比之下，微生物發酵法生產cAMP具有如下的一些優點：條件溫和、工藝簡單、能利用廉價的碳源，副產物少、環境污染小，可實現持續生產等等，是有潛力的、值得大力開發的工藝。

目前利用液化短桿菌、微桿菌、棒狀桿菌、節桿菌、大腸桿菌等細菌發酵法生產cAMP已有一定的研究，但面臨重復性差、產量不穩定、成本高、難以工業化等問題。而酵母尤其是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為最重要的工業微生物之一，不僅具有工業化應用技術成熟、抗逆性強、為食品安全性GRAS微生物的優點，同時作為最早實現全基因組測序的微生物菌種，又是分子生物學和遺傳學研究的最重要模式生物之一，cAMP信號通路及其調控相關的基礎研究深入，遺傳操作技術手段完善。遺憾的是目前國內外的研究都集中于胞內cAMP的信號調控功能，還沒有將其作為一個產品從而關注胞外生產情況的專門研究。若研究酵母胞外cAMP產生規律，并通過基因工程手段改造實現以過量生產胞外cAMP酵母為菌種的發酵法生產，將極大地降低成本、簡化工藝，從而為微生物發酵生產cAMP開辟新的途徑，推動高值醫藥和生化產品的綠色清潔生產，具有重要的經濟價值和社會意義。

發明內容

3.1發明概述Brief Summary of the Invention

本發明的目的是克服上述現有技術存在的不足，提供一種容易培養、適合大規模發酵生產并易于實現產業化的、經過遺傳改造而能過量合成胞外cAMP的酵母菌株，構建此菌株的重組方法及應用。具體地，