[發明專利]用于特異性轉換靶向DNA序列的核酸堿基的單子葉植物的基因組序列的轉換方法、及其使用的分子復合體

有效

• 申請號: 201680079887.5
• 申請日: 2016-11-25
• 公開（公告）號: CN108495932B
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 西田敬二;島古善平;近藤昭彥
• 申請（專利權）人: 國立大學法人神戶大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N9/10;C12N9/16;C12N9/78
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 封新琴

1.修飾單子葉植物細胞的雙鏈DNA的靶向位點的方法，其包括以下步驟，使由核酸堿基轉變酶和與所選擇的雙鏈DNA中的靶核苷酸序列特異性結合的核酸序列識別模塊結合而成的復合體與該雙鏈DNA接觸，將該靶向位點的1個或多個核苷酸缺失或轉換為其它1個或多個核苷酸，或者向該靶向位點插入1個或多個核苷酸，而在該靶向位點中不切割該雙鏈DNA的至少一個鏈，其中，該雙鏈DNA與該復合體的接觸通過向該單子葉植物細胞導入編碼該復合體的核酸，以及培養該單子葉植物細胞以使該復合體在細胞內表達來進行，且其中在核酸序列識別模塊及核酸堿基轉變酶的兩末端各添加一個編碼源自SV40的核定位信號的序列，其中所述核酸序列識別模塊是CRISPR-Cas系統，其中Cas的至少1個DNA切割能力是失活的，且其中所述核酸堿基轉變酶為胞苷脫氨酶。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述培養步驟的至少一部分在與該單子葉植物細胞的最適培養溫度比更低的溫度下進行。

3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述核酸序列識別模塊為與指導RNA形成互補鏈的鏈的相反鏈的切割能力失活的CRISPR-Cas系統。

4.根據權利要求3所述的方法，其中使靶向位點的1個或多個核苷酸缺失。

5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述胞苷脫氨酶為源自七腮鰻的PmCDA1。

6.根據權利要求1~5中任一項所述的方法，其中，編碼核酸序列識別模塊及核酸堿基轉變酶的核酸序列針對被子植物或者單子葉植物的密碼子使用而最優化。

7.根據權利要求1~5中任一項所述的方法，其中，單子葉植物為水稻、小麥或玉米。

8.根據權利要求7所述的方法，其中，單子葉植物為水稻。

9.核酸修飾酶復合體，其為核酸堿基轉變酶和與單子葉植物細胞的雙鏈DNA中的靶核苷酸序列特異性結合的核酸序列識別模塊結合而成的復合體，其在該單子葉植物細胞中起作用，且使該靶向位點的1個或多個核苷酸缺失或轉換為其它1個或多個核苷酸，或者向該靶向位點插入1個或多個核苷酸，而在靶向位點中不切割該雙鏈DNA的至少一個鏈，且其中在核酸序列識別模塊及核酸堿基轉變酶的兩末端各添加一個編碼源自SV40的核定位信號的序列，其中所述核酸識別序列識別模塊是CRISPR-Cas系統，其中Cas的至少1個DNA切割能力是失活的，且其中所述核酸堿基轉變酶為胞苷脫氨酶。

10.編碼權利要求9所述的核酸修飾酶復合體的核酸。

11.根據權利要求10所述的核酸，其中編碼核酸序列識別模塊及核酸堿基轉變酶的核酸序列針對被子植物或者單子葉植物的密碼子使用而最優化。