[發明專利]用于減少接頭-二聚體形成的方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201680079111.3
• 申請日: 2016-11-17
• 公開（公告）號: CN108473985A
• 公開（公告）日: 2018-08-31
• 發明（設計）人: M·托路易;A·莫里斯;K·艾倫
• 申請（專利權）人: 柏爾科學公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6855
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 孫占華;淳于媛

本教導涉及用于減少接頭?二聚體形成的方法，特別是當制備用于隨后擴增和/或測序的目的核酸時。還描述了用于實施某些公開的方法的試劑盒。

相關申請的交叉引用

本申請要求2015年11月17日提交的，題為“用于減少接頭-二聚體形成的方法和試劑盒”的美國臨時申請序列號62/256,662的權益，該臨時申請以引用的形式全文納入本文中。

關于聯邦資助研究的聲明

本研究部分在NSF II期資助號1431020的政府支持下進行。政府可對要求保護的發明享有一定權利。

技術領域

本教導通常涉及核酸測序領域，特別涉及減少接頭二聚體形成。更特別地，本教導涉及改進包含小RNA分子的測序文庫的產生。

背景技術

使用下一代測序技術的小RNA測序(sRNA-seq)對于諸如癌癥、干細胞生物學和表觀遺傳基因調控的領域中的小RNA序型分析和發現而言是非常寶貴的。sRNA-seq文庫制備在歷史上具有三個主要的缺陷：嚴重偏差，需要基于凝膠的純化，以及缺少低輸入方案。減少接頭-二聚體產物的形成是成功產生這些文庫的關鍵方面。

需要通過凝膠(通常通過PAGE凝膠)來純化最終的小RNA測序文庫，這是由于文庫制備的PCR步驟之后接頭-二聚體分子與包含插入片段的分子在尺寸上的小差異。在典型的DNA或RNA文庫制備中，包含插入片段的分子比接頭-二聚體分子至少長100bp，因此可使用固相可逆性固定化(SPRI)磁珠將包含插入片段的分子除去。然而，由于在小RNA文庫中包含插入片段的分子僅比接頭-二聚體分子長約20bp，SPRI尺寸選擇不可行，必須進行基于凝膠的選擇。對基于凝膠的尺寸選擇的需求嚴重限制了小RNA文庫制備的通量和自動化潛力，因為只有有限數目的文庫可在單一凝膠上進行電泳，并且這是不適于自動化的勞動密集型過程。

缺少sRNA-seq的低輸入方案也與接頭-二聚體形成有關。小RNA測序在某種程度上的獨特之處在于，額外的PCR循環導致可忽略的偏差；因此理論上它應該可以通過使用多個PCR循環來產生低輸入小RNA文庫。然而，文庫中存在的接頭-二聚體也會被大量擴增，這最終產生其中接頭-二聚體產物極其豐富的文庫，使得難以分離包含插入片段的產物，并且獲得其中僅有非常少的讀段是有用的測序數據。已開發了許多方法來減少小RNA文庫制備中接頭-二聚體的形成，但遺憾的是，這些方法都無法有效地將接頭-二聚體形成減少到這樣的程度，即使得無凝膠或低輸入小RNA文庫的制備成為可能。

目前有多種方法用于減少接頭-二聚體產物。在這些方法之一中，在第一連接步驟之后互補寡核苷酸退火至3’接頭，這將過量的3’接頭從單鏈DNA轉化為雙鏈DNA。雙鏈DNA對于隨后反應中使用的T4RNA連接酶1酶而言是較差的底物，使得接頭-二聚體產物的形成減少。

sRNA文庫構建的傳統方法已證明具有嚴重的偏差，導致最終的測序結果不能準確地代表起始材料中小RNA的相對豐度。該偏差可通過使用在連接接合處具有隨機化堿基的寡核苷酸接頭而大大減小。然而，當使用具有隨機化末端的接頭時，互補寡核苷酸雜交策略無法良好發揮作用以減少接頭-二聚體形成。因此，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進行的中間連接產物的純化通常用于sRNA文庫制備方案，該方案利用具有隨機化末端的接頭。通過PAGE進行的產物純化具有許多缺點，因此開發了無凝膠、接頭-二聚體減少策略。該策略需要使用與異丙醇和SPRI珠結合的專用試劑，以在第一連接步驟之后耗盡過量的3’接頭，從而減少最終文庫中接頭-二聚體的形成。然而，應當注意的是，該策略和使用常規(含有非隨機化末端的)接頭的策略通常都未能有效地減少接頭-二聚體形成到這樣的水平，即通過PAGE進行的最終純化可被基于SPRI的方法替代。

因此，在某些分子生物學技術中需要用于減少接頭-二聚體產物形成的方法，包括產生核酸測序文庫。例如但不限于，用于RNA(包括小RNA)的下一代測序的RNA文庫。

發明內容