[發(fā)明專利]RNA酶H用于選擇性擴增病毒DNA的用途

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201680074418.4
• 申請日: 2016-12-20
• 公開（公告）號: CN108474031A
• 公開（公告）日: 2018-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: E.H.菲斯
• 申請（專利權(quán)）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848;C12Q1/6851;C12Q1/70
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 梁謀;黃希貴

1.一種用于擴增可能存在于樣品中的DNA靶核酸的方法，所述方法包括下述步驟：

- 使來自樣品的所述DNA靶核酸與擴增試劑、RNA酶H和具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶接觸，所述擴增試劑包含至少一對在合適條件下與所述DNA靶核酸特異性地雜交的寡核苷酸引物；

- 在適合發(fā)生所述具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶對RNA的轉(zhuǎn)錄的條件下在反應(yīng)容器中將所述DNA靶核酸與所述擴增試劑一起溫育一段時間；和

- 在適合發(fā)生指示所述DNA靶核酸的存在或不存在的擴增反應(yīng)的條件下在所述反應(yīng)容器中將所述DNA靶核酸與所述擴增試劑一起溫育一段時間。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶是包含突變的聚合酶，所述突變賦予與相應(yīng)野生型聚合酶相比改善的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述包含突變的具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶源自選自CS5 DNA聚合酶、CS6 DNA聚合酶、海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）DNA聚合酶、水生棲熱菌（Thermus aquaticus）DNA聚合酶、嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）DNA聚合酶、黃棲熱菌（Thermus flavus）DNA聚合酶、絲狀棲熱菌（Thermus filiformis）DNA聚合酶、棲熱菌屬種（Thermus sp.）sps17 DNA聚合酶、棲熱菌屬種Z05 DNA聚合酶、那不勒斯棲熱袍菌（Thermotoga neapolitana）DNA聚合酶、非洲棲熱腔菌（Termosipho africanus）DNA聚合酶和Thermus caldophilus DNA聚合酶的聚合酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述包含突變的具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶源自棲熱菌屬種Z05 DNA聚合酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任一項所述的方法，所述方法還包括：擴增可能存在于所述樣品中的RNA靶核酸。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中的任一項所述的方法，其中所述DNA靶核酸源自乙型肝炎病毒(HBV)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項所述的方法，其中所述樣品是流體樣品。

8.一種用于擴增可能存在于樣品中的DNA靶核酸并確定其量的方法，所述方法包括下述步驟：

- 在適合發(fā)生所述具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶對RNA的轉(zhuǎn)錄的條件下在反應(yīng)容器中將所述來自樣品的DNA靶核酸與擴增試劑、RNA酶H和具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶一起溫育一段時間，所述擴增試劑包含至少一對在合適條件下與所述DNA靶核酸特異性地雜交的寡核苷酸引物；

- 在適合發(fā)生指示所述DNA靶核酸的存在或不存在的擴增反應(yīng)的條件下在所述反應(yīng)容器中將所述DNA靶核酸與所述擴增試劑一起溫育一段時間，所述擴增試劑包含對所述DNA靶核酸特異性的所述寡核苷酸引物；

- 通過參考外部校準(zhǔn)或通過執(zhí)行內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)品，確定所述DNA靶核酸的量。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶是包含突變的聚合酶，所述突變賦予與相應(yīng)野生型聚合酶相比改善的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。