[發明專利]細胞的早期轉染后分離(EPIC)用于生物制品產生有效
| 申請號： | 201680071815.6 | 申請日： | 2016-10-07 |
| 公開（公告）號： | CN108368504B | 公開（公告）日： | 2022-07-19 |
| 發明（設計）人： | V·R·凱恩斯;C·德馬里亞;J·維特科 | 申請（專利權）人： | 建新公司 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10;G01N33/537 |
| 代理公司： | 北京坤瑞律師事務所 11494 | 代理人： | 史悅 |
| 地址： | 美國馬*** | 國省代碼： | 暫無信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 細胞 早期 轉染 分離 epic 用于 生物制品 產生 | ||
1.一種產生表達靶多肽的生產者細胞的群體的方法，所述方法包括：
(a)用編碼一個或多個mRNA的一個或多個載體轉染宿主細胞，其中所述一個或多個mRNA編碼可選多肽和所述靶多肽；
(b)在轉染的2至5天內，從所述轉染的宿主細胞分離表達所述可選多肽的早期表達轉染的宿主細胞的亞群，其中所述分離對于所述可選多肽采用磁性激活的細胞分選(MACS)或熒光激活的細胞分選(FACS)；和
(c)擴大所述早期表達轉染的宿主細胞的分離的亞群，由此產生表達所述靶多肽的生產者細胞的群體，
其中所述生產者細胞的群體與所述轉染的宿主細胞的未選擇的群體相比表達增強水平的所述靶多肽，和
其中步驟(b)和(c)各自在無藥物選擇培養基中進行。
2.根據權利要求1所述的方法，其進一步包括從所述生產者細胞的群體中分離所述靶多肽。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其進一步包括從擴大的亞群中分離一個或多個單一轉染的宿主細胞，和培養所述一個或多個單一轉染的宿主細胞以產生一個或多個單一轉染的宿主細胞的克隆群體。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，與在步驟(c)中獲得的表達所述靶多肽的轉染但未克隆的宿主細胞的穩定的匯集物相比，所述一個或多個單一轉染的宿主細胞的克隆群體的至少一個在靶多肽產生中得到2-30倍的改善。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中，在步驟(b)中經過選擇的轉染的宿主細胞含有至少80-120x106個細胞。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其中，所述步驟(b)中的分離在轉染后2-4天進行。
7.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其中，所述步驟(b)中的分離在轉染后2天進行。
8.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其中，所述步驟(b)中的分離在轉染后3天進行。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的方法，其中，在步驟(c)中的擴大之前，所述轉染的宿主細胞的亞群含有0.5-6.0x106個細胞。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的方法，其中，所述步驟(c)中的擴大進行4-31天。
11.根據權利要求1-10中任一項所述的方法，其中，所述一個或多個載體的第一個編碼mRNA，所述mRNA編碼所述靶多肽，并且所述一個或多個載體的第二個編碼mRNA，所述mRNA編碼所述可選多肽。
12.根據權利要求1-11中任一項所述的方法，其中，所述編碼所述靶多肽的mRNA和所述編碼所述可選多肽的mRNA兩者均在一個載體上編碼。
13.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述可選多肽是FACS可選多肽，并且所述步驟(b)中的分離采用FACS。
14.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述靶多肽和所述可選多肽形成融合多肽。
15.根據權利要求1至13中任一項所述的方法，其中，所述靶多肽和所述可選多肽由單一多順反子mRNA編碼。
16.根據權利要求15所述的方法，其中，所述多順反子mRNA包含編碼所述可選多肽的第一開放讀碼框(ORF)，和編碼所述靶多肽的第二ORF，其中，所述第一ORF位于所述第二ORF的5’。
17.根據權利要求16所述的方法，其中，所述第一ORF具有非AUG起始密碼子。
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