[發明專利]核酸的外泌體包裝

有效

• 申請號: 201680070339.6
• 申請日: 2016-09-30
• 公開（公告）號: CN108368487B
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: D·吉賓斯;J·A·泰勒
• 申請（專利權）人: 渥太華大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;A61K31/7088;A61K35/12;A61K9/00;A61K9/51;C12N15/10;C12N15/113;C12N15/87;C12Q1/6888
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

1.一種用于產生包含基因沉默核酸、目標核酸或其前體的外泌體或外泌體-樣囊泡的方法，所述方法包括：

-引入核酸構建體至外泌體-產生細胞中或在外泌體-產生細胞中表達核酸構建體，所述核酸構建體包含摻入前-miR-451結構模擬物中的基因沉默核酸、目標核酸或其前體；

- 用溶酶體或自噬抑制劑處理所述外泌體-產生細胞；

-從所述細胞產生外泌體或外泌體-樣囊泡；和

-收集或富集所產生的外泌體或外泌體-樣囊泡。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述前-miR-451結構模擬物包含具有平末端、5’突出端、3’突出端或5’和3’松散端且具有25-54個核苷酸(nt)總長的莖-環二級結構。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述前-miR-451結構模擬物包含具有4-8 nt總環長的莖-環二級結構。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述前-miR-451結構模擬物包含在所述莖中具有至少一個堿基對錯配的莖-環二級結構。

5.根據權利要求1所述的方法，其中所述前-miR-451結構模擬物包含具有延伸至Ago2裂解位置或在Ago2裂解位置之前或在Ago2裂解位置之后的3’末端的莖-環二級結構，使得所述前-miR-451結構模擬物包括5’突出端部分和3’堿基-配對部分。

6.根據權利要求1所述的方法，其中所述前-miR-451結構模擬物包含包括3’部分在內的單鏈結構，其模擬成熟miR-451。

7.根據權利要求6所述的方法，其中所述前-miR-451結構模擬物的長度是22-35nt。

8.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述細胞是胚胎干細胞(ESC)克隆H1或H9細胞、間充質干細胞(MSC)、具有低Ago2表達或活性水平的細胞、原代人間充質干細胞、原代小鼠巨噬細胞、人乳腺癌細胞系、小鼠或人神經元細胞系、小鼠星形膠質細胞系、小鼠小神經膠質細胞系、小鼠運動神經元細胞系、HeLa細胞、小鼠胚胎成纖維細胞、或小鼠樹突細胞。

9.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述基因沉默核酸是或來源于miRNA、shRNA、Crispr引導RNA或siRNA。

10.根據權利要求1或2所述的方法，其中將所述細胞在無血清培養基或外泌體-耗盡的血清培養基中培養，同時產生所述外泌體或外泌體-樣囊泡。

11.根據權利要求2所述的方法，其中所述前-miR-451結構模擬物還具有40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52nt的總長。

12.根據權利要求8所述的方法，其中所述細胞是人乳腺癌細胞系MDA-MB-231、小鼠或人神經元細胞系Neuro2a或SHSY、小鼠星形膠質細胞系C8Da或SIM、小鼠小神經膠質細胞系BV2、小鼠運動神經元細胞系NSC-34或MN-1、HeLa細胞、小鼠胚胎成纖維細胞、或小鼠樹突細胞JAWS II。

13.包含摻入前-miR-451結構模擬物中的基因沉默核酸的核酸構建體用于包裝所述基因沉默核酸至由外泌體-產生細胞產生的外泌體或外泌體-樣囊泡中的用途，其中所述核酸構建體用于引入所述細胞中或在所述細胞中表達。