[發明專利]在具有降低的CLR1活性的絲狀真菌中生產蛋白質的方法

在審

• 申請號: 201680069640.5
• 申請日: 2016-12-02
• 公開（公告）號: CN108291191A
• 公開（公告）日: 2018-07-17
• 發明（設計）人: S·哈夫納;A·提維森;H·哈特曼;N·伯默爾
• 申請（專利權）人: 巴斯夫歐洲公司
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C07K14/37;C12P21/00;C12P21/02
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 胡志君;黃革生

1.在絲狀真菌中生產重組多肽的方法，所述絲狀真菌經遺傳修飾以與不具有該遺傳修飾且與被遺傳修飾的絲狀真菌在相同條件下培養的絲狀真菌相比降低或消除纖維素酶調節物1(CLR1)的活性，并且該絲狀真菌被進一步遺傳修飾以表達所述重組多肽，其中所述重組多肽在不能被CLR1活化的啟動子的控制下表達，所述方法包括：

(i)在不含纖維素或其能夠誘導CLR1活性的任何衍生物的培養基中生長所述經遺傳修飾的絲狀真菌；和

(ii)從培養基中分離重組多肽。

2.如權利要求1所述的方法，其中絲狀真菌是嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)。

3.一種絲狀真菌嗜熱毀絲霉，其經遺傳修飾以與不具有該遺傳修飾且與被遺傳修飾的絲狀真菌在相同條件下培養的絲狀真菌相比降低或消除纖維素酶調節物1(CLR1)的活性，并且該絲狀真菌被進一步遺傳修飾以表達重組多肽，其中所述重組多肽在不能被CLR1活化的啟動子的控制下表達。

4.如權利要求1或2所述的方法或如權利要求3所述的絲狀真菌，其中所述重組多肽是對絲狀真菌異源的多肽。

5.如權利要求1、2或4中任一項所述的方法或如權利要求3或4所述的絲狀真菌，其中所述重組多肽是水解酶。

6.如權利要求1、2、4或5中任一項所述的方法或如權利要求3至5中任一項所述的絲狀真菌，其中所述遺傳修飾的絲狀真菌能夠以比不具有該遺傳修飾且與被遺傳修飾的絲狀真菌在相同條件下培養的絲狀真菌更高的純度積累重組多肽。

7.如權利要求1、2或4至6中任一項所述的方法或如權利要求3至6中任一項所述的絲狀真菌，其中所述CLR1活性的降低或消除歸因于減少或消除編碼CLR1蛋白的核酸分子的表達。

8.如權利要求7所述的方法或絲狀真菌，其中所述編碼CLR1蛋白的核酸分子包含選自以下的核酸序列：

(a)根據SEQ ID No.1或2的核酸序列或其功能部分；

(b)編碼根據SEQ ID No.3的多肽或其功能部分的核酸序列；和

(c)編碼具有CLR1活性的多肽且與根據SEQ ID No.1或2的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列。

9.如權利要求1、2或4至8中任一項所述的方法或如權利要求3至8中任一項所述的絲狀真菌，其中所述絲狀真菌包含至少一種額外的遺傳修飾。

10.如權利要求9所述的方法或絲狀真菌，其中所述至少一種額外的遺傳修飾降低或消除轉錄因子和/或蛋白酶的活性。

11.如權利要求10所述的方法或絲狀真菌，其中所述轉錄因子是木聚糖酶調節物1(XYR1)。

12.如權利要求10或11所述的方法或絲狀真菌，其中蛋白酶是堿性蛋白酶1(ALP1)。

13.降低或消除CLR1活性的核酸構建體的用途，用于增加絲狀真菌中產生的重組多肽的純度和/或量。

14.如權利要求13所述的用途，其中CLR1的活性通過減少編碼CLR1蛋白的核酸分子的表達而降低。

15.如權利要求13或14所述的用途，其中編碼CLR1蛋白的核酸分子包含選自以下的核酸序列：

(a)根據SEQ ID No.1或2的核酸序列或其功能部分；

(b)編碼根據SEQ ID No.3的多肽或其功能部分的核酸序列；和

(c)編碼具有CLR1活性的多肽且與根據SEQ ID No.1或2的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列。

16.權利要求3至12中任一項所述的絲狀真菌的用途，用于生產重組多肽。