[發明專利]一種在淋巴細胞中高水平的和穩定的基因轉移的方法

在審

• 申請號: 201680068108.1
• 申請日: 2016-09-22
• 公開（公告）號: CN108601849A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發明（設計）人: 邁克爾·胡德塞克;佐爾坦·伊維奇
• 申請（專利權）人: 尤利烏斯·馬克西米利安維爾茨堡大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;C12N15/90;C12N15/64;A61K35/17;C12N5/0783;C07K14/705
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;黃益澍

本發明公開的方法描述了一種能夠以空前的效率、靈活性、實用性和速度將轉基因穩定整合到淋巴細胞和其他哺乳動物細胞中的新技術。該新方法是基于使用mRNA編碼的轉座酶[例如睡美人(Sleeping Beauty)轉座酶]與微環DNA編碼的轉座因子的組合。該新方法能夠實現更高的基因轉移速率，同時比常規方法毒性低，所述常規方法即使用質粒DNA編碼的轉座酶與質粒DNA編碼的轉座因子的組合。本發明的應用包括但不限于將編碼免疫受體(例如T細胞受體或合成嵌合抗原受體)的轉基因穩定整合到人T淋巴細胞中，其中免疫受體對腫瘤細胞表達的分子具有特異性。轉座酶mRNA和轉座子微環DNA可通過包括但不限于如電穿孔和核轉染的電轉移方法導入淋巴細胞中。

技術領域

本發明涉及基因轉移的方法和技術以及免疫治療的方法和技術。

背景技術

越來越多的基因修飾的細胞和組織被應用于生物體的診斷和治療當中。例如通過引入一個或幾個轉基因賦予細胞新的特性，或通過引入一個或幾個基因修飾子來調節或除去不同的特性和功能來進行基因修飾。基因修飾的細胞應用在治療中的一個令人印象深刻的例子是工程化T細胞的應用，通過基因轉移對該工程化T細胞進行修飾使其表達能夠識別腫瘤細胞表達的分子的T細胞受體(TCR)或合成的嵌合抗原受體(CAR)，并因此賦予該工程化T細胞的抗腫瘤特異性。臨床前的腫瘤模型以及晚期化療和放療的難治性惡性腫瘤患者的臨床試驗中有令人信服的證據表明，這些工程化TCR-和CAR-修飾的T細胞具有抗腫瘤能力和治療潛力(Hudecek Blood 2010；Hudecek Cancer Immunol Res 2013；HudecekCancer Immunol Res 2015；Hudecek Leukemia 2015；Kalos Science Transl Med 2011；Grupp N Engl J Med 2013；Davila Science Transl Med 2014；Maude N Engl J Med2014)。

實現基因轉移到T細胞中的最常用策略是使用病毒遞送系統，如逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒載體。病毒遞送系統已被用于將包括TCR和CAR的轉基因穩定整合到人T淋巴細胞中，從而能夠制造在臨床前和臨床時使用的腫瘤反應性TCR-/CAR-T淋巴細胞。尤其例如，已經證實整裝了對CD19具有特異性的合成嵌合抗原受體(CAR)的工程化T細胞在中試研究中對B細胞惡性腫瘤具有顯著的療效(參考文獻1-3)。在迄今為止報道的所有CD19-CAR T細胞療法具有功效的臨床試驗中，都是使用整合的慢病毒(LV)或γ-逆轉錄病毒(RV)載體來實現CAR基因的轉移和表達。然而，與病毒的基因轉移載體相關的應用有許多概念性的、技術上的和策略上的缺陷，包括隨時間推移的轉基因沉默、優先整合到基因組的轉錄活性位點中時伴隨著其他基因的非期望激活(例如癌基因)和遺傳毒性的非期望潛能；以及制造、儲存和處理整合病毒的費用和繁瑣的努力——其中后者妨礙了它們在治療應用中更廣泛地應用于制造基因修飾的T細胞。因此，病毒載體在安全性方面以及在全球范圍內建立CAR T細胞治療所需的載體生產的成本和規模一直受到持續關注。

轉座子技術是實現穩定基因轉移的另一種策略。轉座子或轉座因子(TE)是能夠穩定整合到宿主細胞基因組中的遺傳元件，這個整合到宿主細胞基因組中的過程稱為轉座(Ivics Mobile DNA 2010)。早在20世紀50年代，Barbara McClintock在玉米的遺傳學研究中就推測到了TE的存在，但直到20世紀70年代末才描述了用于細菌TE的第一個轉座功能模型(Shapiro PNAS 1979)。同時顯而易見地是，TE存在于每個生物體的基因組中，并且基因組測序顯示約45％的人類基因組是來源于轉座子(International Human GenomeSequencing Consortium Nature 2001)。然而，與已經確定功能性(或自主性)TE的無脊椎動物相反，人類和大多數高等脊椎動物不包含功能性TE。據推測，進化過程中的選擇壓力抵抗TE的致突變潛力，導致其在數百萬年前的進化過程中發生功能性失活。