[發明專利]循環細胞、蛋白質和核酸的體內收集和局部定量以及特征分析

在審

• 申請號: 201680065740.0
• 申請日: 2016-11-09
• 公開（公告）號: CN108430336A
• 公開（公告）日: 2018-08-21
• 發明（設計）人: 安妮卡·阿爾福德;阿敏·艾拉-海萊比;馬茨·尼爾森·伯尼茨
• 申請（專利權）人: 格拉茨醫科大學
• 主分類號: A61B10/00
• 分類號: A61B10/00;C12Q1/68
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

本發明涉及通過收集裝置體內捕獲的循環細胞內RNA或蛋白質的原位局部多重檢測，或者通過所述裝置捕獲的游離循環核酸的檢測。所述裝置包括配備有檢測受體的功能性三維捕獲表面，并且所述分子分析基于高度特異的掛鎖探針連接或鄰位連接技術(PLA)，隨后進行滾環擴增(RCA)。

技術領域

本發明涉及體外診斷學的技術領域。

發明背景

由于特定轉錄本的表達水平在異種細胞群中會變化，因而期望以特異性且定量的方式直接在單細胞內原位檢測mRNA。此外，最終歸結為單核苷酸解析的單分子靈敏度對研究序列變異(包括點突變、等位基因失活或表達轉錄本的剪接和拷貝數變化)至關重要。已經將等位基因轉錄本相對表達中的差異或單核苷酸序列變體的存在鑒定為重要的診斷疾病生物標志物，特別是用于診斷不同的癌癥。當前用于整體分析較大數目細胞的分析可能不能檢測稀有細胞中的分子，也不能提供關于各分子的細胞來源的信息。因此，與異種細胞群中的平均表達水平相比，這些方法不能準確地反映單細胞中表達的可能偏差。在單細胞水平檢測單一mRNA分子是可能的，例如通過熒光原位雜交(FISH)或者通過對激光捕獲顯微切割材料進行聚合酶鏈式反應(PCR)。然而，用FISH不能分辨高度相似的序列和序列變體，而顯微切割非常麻煩且不適用于診斷。此外，這兩種方法還限于一次分析單一/少量標志物。

基于掛鎖(padlock)探針的分析依賴于靶標依賴性環化事件之后通過高度特異性的探針雜交進行的核酸靶標檢測(Nilsson等，1994)。具體而言，掛鎖探針由在每個末端具有互補序列的寡核苷酸組成(Larsson C，Nat Methods 2010)。在與靶標核酸序列結合時，掛鎖探針形成DNA環。將DNA環連接起來，并將錨定序列作為引物用于后續的滾環擴增(RCA)。RCA是等溫PCR，其將循環模板放大百倍，產生滾環產物(RCP)(Ali MM等，HYPERLINKhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

24643375\o“Chemical Society reviews.”Chem Soc Rev.2014)。然后可以通過熒光雜交探針容易地靶向RCP。連接反應的高度特異性和探針之間低水平的相互作用允許多種標志物的多重問詢。通過熒光探針雜交和顯微鏡檢測以數字方式定量擴增產物。已經建立用于mRNA靶標的原位多重檢測的分子原理(Larsson C.等，Nature Methods 2010；Grundberg I.等，Oncotarget 2013；專利：IB2012/000995)，其中各單一靶標分子在細胞和組織切片中產生一個可直接檢測的不同的擴增產物，從而提供空間信息，即表達的轉錄本在單細胞水平的位置。連接反應的高度特異性使得靶標區分歸結為單核苷酸解析，這允許直接解析序列變異。

通過將RCA程序與下一代測序化學法(next generation sequencing chemistry)組合進一步開發用于高度多重原位轉錄本分析的技術，這允許在單個細胞中直接進行平行條形碼測序(Ke R.等，Nature Methods2013)。對于條形碼測序，將錨定引物在RCP進行雜交，與由包含8個隨機位點和1個固定位點(G、C、A或T)的9-mer組成的問詢探針直接相鄰。用不同的熒光團標記各問詢探針。連接之后，將樣品成像，并且各RCP顯示相應的固定堿基的顏色。然后洗去第一組問詢探針，并將一組新的問詢探針應用于新的固定位點(一個堿基對位移)。重復這些連接、成像和洗滌的步驟，直到所有條形碼堿基都被讀取(Ke R.等，NatureMethods 2013)。